Estabelecendo um modelo de doença de Alzheimer no cérebro de peixe-zebra por meio de injeção de peptídeo amilóide

Resumo

Bhattarai, P., et al. Modelagem da toxicidade e neurodegeneração do amilóide-β42 no cérebro do peixe-zebra adulto. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra o procedimento de injeção de peptídeos amilóides monoméricos no prosencéfalo de peixes-zebra adultos para gerar toxicidade amilóide, imitando o dano neuronal observado na doença de Alzheimer

Protocolo

1. Preparação do Peptídeo Aβ42

1. Sintetizar peptídeos (ver Tabela 1) usando a química padrão de 9-fluorenil metoxicarbonila (Fmoc) com 2- (1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametiluronônio hexafluorfosfato (HBTU) como reagente de acoplamento em um sintetizador de peptídeos de fase sólida automatizado. A escala da síntese foi de 100 μmol.
2. Carregue o sintetizador de peptídeos automatizado com 500 mg da resina protegida com Fmoc como fase sólida (capacidade de carga de 0,2 mmol / g). Carregue os aminoácidos protegidos com Fmoc dissolvidos a uma concentração de 0,5 M no volume necessário e conforme calculado para o respectivo sintetizador.
   nota: Os cálculos são feitos para permitir o acoplamento de cada aminoácido protegido por Fmoc duas vezes com 5 vezes o excesso de cada bloco de construção à resina.
3. Dissolva os reagentes necessários para a síntese de peptídeos em dimetilformamida (DMF). Por exemplo, prepare o ativador, HBTU, a uma concentração de 0,48 M, 45% v/v de N-metilmorfolina (NMM) (a base) e 5% de v/v de anidrido acético (a mistura de capeamento) para tampar os grupos amino não reagidos.
4. Cortar todos os peptídeos da resina misturando continuamente o suporte sólido usando um agitador em uma mistura de clivagem recém-preparada consistindo de ácido trifluoroacético (TFA): triisopropilsilano (TIS): água: ditiotreitol (DTT) a 90 (v / v): 5 (v / v): 2,5 (v / v): 2,5 (m / v) por 4 h. Use 10 mL para a escala de síntese de 100 μmol.
5. Precipitar o produto clivado adicionando a mistura de clivagem a 100 ml de éter dietílico gelado. Passar por uma unidade de filtração contendo um filtro de politetrafluoretileno (PTFE) com poros de 0,45 μm e lavar com 20 mL de éter dietílico gelado.
6. Coletar o peptídeo filtrado do papel de filtro e dissolver 100 mg de peptídeo precipitado em 5 mL de água destilada deionizada: acetonitrila a 1:1.
7. Purificar por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) de fase reversa numa HPLC semipreparativa equipada com uma coluna porosa de poliestireno divinilbenzeno com um tamanho de grânulo de 10 μm.
   1. Pré-aqueça a coluna e mantenha-a a 50 °C usando um dispositivo de aquecimento da coluna. Colete todas as frações principais usando um coletor de frações automatizado aplicando um gradiente de 5% a 100% de solvente B durante 25 min a 4 mL/min.
      nota: O solvente A é 0,1% de TFA em água e o solvente B é 0,1% de TFA em acetonitrila.
   2. Monitorizar o cromatograma a 220 nm, recolher os picos adequados e analisar por cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS).
8. Confirme a pureza por cromatografia líquida analítica de fase reversa de ultra-alta pressão (UPLC) a 220 nm, monitorando com um detector ultravioleta (UV) enquanto passa a amostra por uma coluna analítica C18 (tamanho do grânulo de 1,7 μm). Confirmar o produto peptídico por espectrometria de massas.
   nota: O UPLC é acoplado a uma espectrometria de massa de ionização por eletrospray (ESI-MS) e a um detector quadrupolo em tandem.
9. Liofilize as frações corretas do peptídeo desejado em um frasco de fundo redondo aplicando um vácuo de 0,052 mbar a um pó fofo. Acople a bomba de vácuo a uma unidade de congelamento mantida a -78 °C. Armazene a -80 °C indefinidamente.
10. Use o peptídeo liofilizado para preparar uma solução estoque de 1 mM em uma mistura de acetonitrila, DMF e água de grau analítico a 1:1:1 para os experimentos. Esta solução pode ser armazenada por pelo menos 6 meses, pois os peptídeos não se agregam nela.

2. Preparação da mistura para injecções

1. Prepare solução salina tamponada com fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7,4) para diluir os peptídeos liofilizados.
2. Dissolver o peptídeo até uma concentração final de 20 μM em PBS. Prepare esta solução fresca. Misture bem e guarde no gelo até a injeção. Não exceda 30 min para evitar a agregação na solução.

3. Anestesia

1. Prepare a solução estoque dos anestésicos, m-m-aminobenzoato de etil-m-aminobenzoato de manossulfonato (MESAB), em água de peixe regular do sistema circulante. Preparar a solução de anestesia até uma concentração final de 0,0025% (v/v).
2. Remova o número desejado de peixes de seus tanques para um recipiente de transporte com 5 L de água do sistema.
3. Encha até a metade uma placa de Petri de plástico (90 mm) com 40 mL de anestésicos. Use este prato para preparações injetáveis.
4. Incubar os peixes nos anestésicos até que o movimento opercular tenha cessado.

4. Microinjeção cerebroventricular

1. Preparação do aparelho de injecção
   1. Preparar os capilares de injecção de vidro utilizando um extractor de agulhas com os seguintes parâmetros: ciclo de aquecimento, 537; ciclo de puxar, 250; velocidade, 1,5 s; tempo, 80 ms.
   2. Traga a configuração de pressão na fonte de pressão para 25 psi.
   3. Defina os parâmetros do microinjetor para 20 psi para retenção e 10 psi para ejeção, 2.5 para período e 100 ms para gating.
   4. Carregue o capilar de vidro com a solução de injeção. Insira o capilar de vidro no suporte de microinjeção. Ajuste o ângulo de injeção para 45°.
2. Coloque um peixe em uma nova placa de Petri cheia de solução de anestesia.
3. Segure o peixe com o fórceps e oriente-o para a injeção.
4. Gere uma fenda usando a ponta de uma agulha de 30 G no crânio sobre o tectum óptico onde as duas placas laterais se encontram. Não insira a ponta no tecido cerebral, isso causaria sangramento e danos.
5. Insira o capilar de vidro na fenda.
   1. Use apenas a ponta da agulha e não penetre mais de 1 mm no crânio. Continue segurando o peixe e insira a ponta do capilar de vidro no local da incisão.
   2. Oriente a ponta do capilar de vidro em direção ao telencéfalo em um ângulo de 45°. Injetar 1 μL da solução. O líquido se dispersa imediatamente após a injeção.

5. Recuperação

1. Coloque o peixe de volta em um contêiner de transporte até que ele se recupere. Conecte o recipiente à água de peixe que circula regularmente para garantir a qualidade ideal da água.
   nota: A recuperação normalmente deve levar 1 minuto. Se demorar mais, o peixe deve ser mantido nos anestésicos por menos tempo (o experimentador precisa otimizar isso).

Resultados

Tabela 1: Sequências dos peptídeos Aβ42 e TR-Aβ42.

peptídeo	Sequência de Peptídeos	MW (g/mol)
Aβ42	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA	Rolamento 4514.1
TR-Aβ42	GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAII...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Aminoácidos protegidos por Fmoc	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemanha)		Aminoácidos à base de Fmoc para síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS)
Hexafluorofosfato de urônio (HBTU) de N,N,N',N'-tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)urônio (HBTU)	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemanha)	RL-1030	ativador
Oxima	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemanha)	RL-1180	Supressor de racemização
N,N-Diisopropiletilamina	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemanha)	SOL-003	base
Dimetilformamida	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemanha)	SOL-004	solvente
N-metilmorfolina	Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Alemanha	A12158	base
Hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBT)	Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, EUA)	157260 ALDRICH	ativador
Piperidina	MERCK KGaA (Darmstadt, Alemanha)	822299	Reagente de desproteção Fmoc
Diclormetano (DCM)	MERCK KGaA (Darmstadt, Alemanha)	Rolamento 106050	solvente
Ácido fórmico (FA)	MERCK KGaA (Darmstadt, Alemanha)	100264	Componente tampão para HPLC
Ácido trifluoroacético (TFA)	MERCK KGaA (Darmstadt, Alemanha)	Rolamento 808260	Reagente de mistura de levagem
Triisopropilsilano (TIS)	MERCK KGaA (Darmstadt, Alemanha)	233781 ALDRICH	Reagente de mistura de levagem
Acetonitrila (para UPLC/LCMS)	Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH	34967-1L	solvente
Acetonitrilo (para HPLC)	VWR International Ltd, Inglaterra	Rolamento 83639.32	solvente
Dietileno	VWR International Ltd, Inglaterra	Rolamento 23811.326	Solvente para precipitação de peptídeos
Ditiotritol (TDT)	VWR International Ltd, Inglaterra	0281-25G	Reagente de mistura de levagem
Resina amida para pista TentaGel S RAM Fmoc	Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Alemanha)	S30023	Fase sólida para SPPS
Seringas de síntese de peptídeos de 5 ml com filtros incluídos	Intavis AG (Colônia, Alemanha)	34.274	Tubo de reação para SPPS e para clivagem da fase sólida
Filtro de politetrafluoretileno (PTFE)	Sartorius Stedtim (Aubagne, França)	11806-50-N	Filtração de peptídeos precipitados
Filtro de seringa de fluoreto de polivinilideno (PVDF)	Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe	KC78.1	Pré-filtragem para HPLC
Sintetizador de peptídeos	Intavis, Colônia, Alemanha	ResPep SL	Sintetizador automatizado de peptídeos em fase sólida
HPLC da Water Alliance	Waters, Milford, Massachusetts, EUA	Águas 2998, Águas e2695	Cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) semipreparativa de fase reversa
PolymerX, tamanho do cordão 10μm, 250x10 mm	Phenomenex Ltd. Alemanha	00G-4328-N0	Coluna de HPLC de poliestireno poroso divinilbenzeno
Milli-Q Advantage A10, com filtro Milli-Q	EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, EUA	LCPAK0001	Sistema de purificação de água
Unidade de Filtração	Sartorius Stedtim (Aubagne, França)	Rolamento 16307	Unidade de filtração para precipitação de peptídeos
UPLC Aquity com detector UV	Waters, Milford, Massachusetts, EUA	M09UPA 664M	Ultra-HPLC de fase reversa analítica para LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, tamanho do cordão 1,7 μm, 50x2,1 mm	Waters, Milford, Massachusetts, EUA	186002350	Coluna analítica C18
Detector ACQUITY TQ	Waters, Milford, Massachusetts, EUA	QBB908	Espectrometria de massas por ionização por eletrospray (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6	Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Alemanha	16706, 101542	Liofilizador com bomba de vácuo
Leitor de placas Paradigm	Beckman Coulter
MESAB (metanossulfonato de etil-m-aminobenzoato)	Sigma-Aldrich	Rolamento A5040
Placas de Petri	Sarstedt	821.472
Solução salina tamponada com fosfato	Tecnologias da Vida, GIBCO	10010-056
agulha	Becton-Dickinson	305178
Microscópio de dissecação	Olympus, Leica, Zeiss	Varia de acordo com o fabricante
Pinças Dumont	Instrumentos de precisão mundiais	501985
Pinça de dissecação de Gillies	Instrumentos de precisão mundiais	501265
Capilares de injeção de vidro	Instrumentos de precisão mundiais	TWF10
PicoNozzle	Instrumentos de precisão mundiais	Rolamento 5430-12
PicoPump Pneumático	Instrumentos de precisão mundiais	SYS-PV820
Iluminador de anel; Guia de luz do anel	Parkland Científico	ILL-RLG