Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Prepare instrumentos cirúrgicos e soluções para cirurgia
- Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos de aço inoxidável.
- Prepare etanol a 70% diluindo etanol absoluto de 200 provas com água destilada desionizada de grau molecular estéril.
- Encaixe a agulha 29 G na seringa Hamilton. Limpe o interior da seringa e da agulha Hamilton aspirando e ejetando água nanopura repetidamente por 1 min. Repita este procedimento com etanol a 70%.
- Remova o êmbolo e a agulha da seringa Hamilton. Seque as peças ao ar em uma coifa de fluxo laminar O/N.
- Irradie a agulha e a seringa com luz ultravioleta por 30 min antes de usar.
- Prepare uma solução salina dissolvendo cloreto de sódio (NaCl) em água de grau molecular até uma concentração final de peso a volume de 0,9%. Esterilize a solução filtrando-a através de um filtro de poros de 0,2 μm.
2. Preparar beta-amilóide oligomérica (Aβ1-42)
- Monomerizar e ressuspender o Aβ1-42 humano recombinante em dimetilsulfóxido (DMSO) a 5 mM exatamente como descrito na publicação de Fa' e outros.
- Diluir 5 mM Aβ1-42 com solução salina estéril (1x) tamponada com fosfato (PBS) até 100 μM no dia anterior à cirurgia.
- Misture bem a solução por trituração.
- Incubar a solução Aβ1-42 por 12 horas a 4 ° C.
nota: Soluções de controle, como diluir DMSO em PBS ou peptídeo Aβ1-42 embaralhado / reverso, devem ser preparadas da mesma maneira que Aβ1-42.
3. Determine as coordenadas de injeção
- Use o atlas cerebral de camundongos adultos para determinar as coordenadas exatas ântero-posterior (AP), medial-lateral (ML) e dorsal-ventral (DV) para a região cerebral de interesse.
nota: Para ilustrar a técnica, escolhemos o giro dentado do hipocampo como alvo com as seguintes coordenadas do bregma: AP, -2,00 mm; ML, ±1,3 mm; DV, -2,2 mm. O sinal negativo que precede o valor AP indica que ele está 2,00 mm posterior ao bregma. O sinal de ± que precede o valor de ML indica a direção esquerda e direita do centro. Por fim, o sinal negativo que precede o DV indica que ele está se movendo ventralmente a partir da superfície do cérebro.
4. Configuração do quadro estereotáxico
- Use uma máscara cirúrgica, um jaleco limpo e luvas cirúrgicas estéreis.
- Limpe o instrumento estereotáxico e o adaptador do mouse com 70% de etanol.
- Coloque uma cortina cirúrgica estéril no balcão.
- Coloque o instrumento estereotáxico com um adaptador de mouse em cima do campo cirúrgico estéril.
- Limpe a almofada de aquecimento do mouse com etanol a 70%. Posicione a almofada de aquecimento sobre a base da estrutura estereotáxica. Use fita adesiva de laboratório de uso geral para prender a almofada de aquecimento sobre a cama do adaptador do mouse.
- Conecte a almofada de aquecimento à bomba de recirculação de água quente de acordo com as instruções do fabricante.
- Ligue a bomba de recirculação de água quente, ajuste a temperatura para 37 °C e espere até atingir essa temperatura.
- Fixe a seringa Hamilton de 50 μl com uma agulha de 29 G na estrutura estereotáxica, aparafusando-a no eixo de injeção vertical motorizado de acordo com as instruções do fabricante.
- Ligue o esterilizador de esferas e aguarde até atingir a temperatura predefinida pelo fabricante.
nota: Isso é usado para esterilizar instrumentos de aço inoxidável entre animais. Os instrumentos levam 20 segundos de contato com os grânulos para esterilização.
- Ligue a placa de aquecimento, ajuste-a para 42 °C e coloque uma gaiola vazia limpa em cima.
- Enquanto a seringa de Hamilton está fixada na estrutura estereotáxica, use o injetor estereotáxico motorizado para extrair a solução Aβ1-42.
nota: Aspirar mais de 4 μl da solução para a seringa e, em seguida, utilizar o injector estereotáxico para regular o volume de injecção. Opere o injetor de acordo com as instruções do fabricante.
5. Preparação Animal
- Determine o peso do mouse usando a balança.
- Anestesiar camundongo com coquetel de cetamina/xilazina a 100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina injetando por via intraperitoneal (IP). Monitore a profundidade da anestesia pela perda do reflexo de pinça do dedo do pé.
- Depois que o mouse estiver sedado, pegue a máquina de cortar cabelo e raspe a cabeça para expor a pele sobre o crânio.
- Coloque o mouse em cima da almofada de aquecimento em cima da cama estereotáxica.
- Use a espátula para abrir a boca e coloque os dentes incisivos dentro do protetor de dentes. Prenda o revólver sobre a face do mouse. Aperte-o suavemente e não muito apertado.
- Posicione as barras transversais bilaterais da orelha no conduto auditivo para prender a cabeça. Mova cada barra transversal até atingir o crânio e, em seguida, gire o parafuso para travá-la.
- Para garantir que a cabeça esteja presa, use o dedo indicador para empurrar suavemente a cabeça para baixo. Se a cabeça estiver devidamente presa, ela não cederá ou se moverá quando pressionada.
- Aplique uma gota de creme para os olhos ou um colírio nos olhos para mantê-los úmidos. Certifique-se de que os olhos estejam úmidos durante todo o procedimento cirúrgico.
- Para desinfetar o local da cirurgia, use cotonetes estéreis para aplicar a solução de betadina na pele sobre o crânio, seguida de etanol a 70%. Realize a limpeza alternada de betadina e etanol a 70% mais 2 vezes.
6. Cirurgia e Infusão
- Use um bisturi para fazer uma incisão de 2-3 mm na linha média do couro cabeludo e, em seguida, use uma tesoura reta e fina para estender a linha de incisão para 1,0-1,5 cm para expor a sutura sagital, bregma e lambda do crânio, pontos de referência nos quais as coordenadas estereotáxicas são baseadas. Use micro grampos para manter a pele afastada.
nota: As posições bregma e lambda são explicadas no atlas do cérebro do camundongo "O cérebro do camundongo em coordenadas estereotáxicas".
- Pegue um cotonete, mergulhe-o em solução salina estéril e use-o para limpar o crânio. Em seguida, use um cotonete limpo e seco para secar o crânio.
- Use uma caneta de ponta fina estéril para marcar um ponto no bregma. Use o micromanipulador estereotáxico para posicionar a seringa Hamilton de forma que a ponta da agulha toque apenas o ponto no bregma.
- Registre a coordenada DV.
- Para verificar se o eixo AP do crânio está nivelado, mova a seringa de Hamilton posteriormente para que a ponta da agulha toque o ponto lambda.
- Grave a posição DV. Certifique-se de que as coordenadas DV para bregma e lambda estejam dentro de 0,5 mm.
nota: O objetivo é minimizar a diferença de DV entre bregma e lambda.
- Use o micromanipulador para retornar a ponta da agulha da seringa Hamilton de volta ao ponto de bregma.
- Registre a posição inicial do AP.
- Calcule a posição final do PA subtraindo 2,00 mm da coordenada inicial do PA.
- Use o micromanipulador para reposicionar a agulha da seringa Hamilton na coordenada AP final.
- Registre a coordenada de ML atual.
- Calcule as coordenadas ML finais esquerda e direita adicionando ou subtraindo 1,3 mm da coordenada ML inicial.
- Use o micromanipulador para mover a agulha da seringa de Hamilton para a coordenada ML final.
- Toque a ponta da agulha na superfície do crânio em ambas as coordenadas ML finais e registre as coordenadas DV e certifique-se de que os valores estejam dentro de 0,5 mm.
NOTA: O objetivo é minimizar a diferença de DV entre as duas coordenadas ML finais.
- Enquanto estiver em uma coordenada final, puxe a agulha 0,5-1 cm acima do crânio. Pegue uma caneta de ponta fina estéril para marcar um ponto na superfície do crânio. Repita esta etapa para o lado contralateral do crânio.
- Gire a seringa Hamilton para fora do caminho.
- Fixe a cabeça da broca de 0,8 mm à broca. Pegue a broca com as duas mãos, coloque os cotovelos na superfície da mesa para estabilidade e posicione a cabeça da broca ligeiramente acima do ponto sharpie na coordenada ML esquerda ou direita. Ative a broca, abaixe a ponta da broca na superfície do crânio para introduzir um orifício no crânio. Repita esta etapa para o lado contralateral.
nota: Pode ocorrer algum sangramento nos orifícios recém-introduzidos. Se houver sangramento, use um cotonete limpo e seco para enxugar o sangue.
- Mova a seringa Hamilton de volta para a posição sobre qualquer um dos orifícios ML recém-introduzidos. Abaixe a agulha de Hamilton logo após o crânio. Neste ponto, tome cuidado para não perfurar o cérebro. Para ter certeza de que a agulha passou pelo crânio, pegue o dedo indicador e empurre suavemente a agulha contra o crânio para garantir que a agulha não saia do orifício.
- Registre a coordenada DV inicial.
- Calcule a coordenada DV final subtraindo 2,2 mm da coordenada DV inicial.
- Abaixe a agulha até a coordenada DV final.
- Ative a bomba injetora estereotáxica para bombear 4 μl de Aβ1-42 para o giro dentado a uma taxa de 0,5 μl/min.
- Quando a perfusão estiver concluída, deixe a agulha permanecer no lugar durante mais 1 minuto para minimizar o refluxo da solução para fora do local da injeção.
- Mova a agulha para o outro lado do cérebro e repita as etapas 6.13-6.18.
7. Remoção de animais e cuidados pós-operatórios
- Desaparafuse as barras auriculares e o protetor facial/nariz. Remova o mouse do aparelho.
- Use uma pinça de padrão padrão de estudante para fechar o couro cabeludo e, em seguida, selar a ferida com uma sutura.
