Estudando o acúmulo de alfa-sinucleína em neurônios embrionários primários de dopamina de camundongo

Abstract

Fonte: Er, S. et al., Estudando o acúmulo de α-sinucleína induzida por fibrilas pré-formadas em neurônios dopaminérgicos primários do mesencéfalo de camundongos.J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra o processo de quantificação do acúmulo de alfa-sinucleína em neurônios de dopamina embrionários de camundongos pré-tratados com fibrilas pré-formadas de alfa-sinucleína. Ele descreve as etapas para fixar, corar e quantificar os neurônios dopaminérgicos contendo agregados de alfa-sinucleína usando imunofluorescência.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Preparação

1. Prepare o meio de neurônio dopaminérgico (DPM) com 0,46% de D-glicose, 1% de L-glutamina, 1% de N2, 0,2% de primocina, completado com DMEM / F12. Filtre o DPM depois de misturar os ingredientes. Armazene o DPM a 4 °C e aqueça cada alíquota apenas uma vez.
   nota: A DPM não deve conter o fator neurotrófico derivado da glia (GDNF), pois reduzirá o acúmulo de α-sinucleína nos neurônios dopaminérgicos.
2. Prepare pipetas de vidro siliconizadas que são extremamente hidrofóbicas, minimizando assim a fixação à superfície e a perda de células durante o manuseio inicial dos neurônios embrionários.
   1. Adicione 10 mL de fluido siliconizante a 1 L de água destilada e misture mexendo em um recipiente de 2 L. Deixe as pipetas de vidro imersas na solução de siliconização por 15 min.
   2. Enxágue as pipetas 3–5x com água destilada. Seque as pipetas durante a noite à temperatura ambiente (RT) ou por 1–2 h a 100-120 °C em espaço estéril aquecido para acelerar a secagem.
   3. Esterilize as pipetas por autoclave padrão em um saco de autoclave lacrado.
3. Prepare placas de 96 poços revestidas com poli-L-ornitina (PO) com fundo transparente, adicionando 60 μL de solução de PO nos poços intermediários da placa de 96 poços a serem usados para semear os neurônios, deixando pelo menos uma linha / coluna de poços nas bordas da placa para evitar efeitos de borda. Manter a placa revestida durante a noite a 4 °C ou 4 h em RT.
4. Antes de plaquear as células, aspire PO completamente e lave as células três vezes com 100 μL de 1x solução salina tampão fosfato (PBS). Aspire 1x PBS dos poços e mantenha a tampa da placa aberta para secagem completa.
   nota: É possível coletar PO usado e filtrá-lo para reutilização. Isso pode ser repetido duas vezes para a mesma solução de PO.
5. Adicione 50 μL de DPM aos poços previamente revestidos. Aspire o DPM dos poços com uma ponta plástica de 100 μL e, simultaneamente, arranhe o fundo do poço com movimentos circulares para remover o revestimento no perímetro de cada poço. Uma ilha revestida de PO permanecerá no meio do poço.
6. Sob uma capa laminar, adicione 10 μL de DPM ao meio de cada ilha revestida para criar micro ilhas.
   nota: Uma placa com micro ilhas cobertas com DPM pode ser mantida sob a capela de fluxo laminar por 1–2 h durante o isolamento das células.

2. Isolamento do assoalho do mesencéfalo ventral de embriões de camundongos E13.5

NOTA: Consulte a Figura 1 para obter as etapas de dissecção do assoalho do mesencéfalo.

1. Antes da dissecação, encha uma placa de Petri de 10 cm com tampão de Dulbecco e mantenha-a no gelo.
2. Eutanasiar um camundongo fêmea grávida E13.5 de acordo com as diretrizes da instituição. Coloque o camundongo deitado de costas e borrife a parte anterior do corpo com etanol a 70%. Levante a pele acima do útero com uma pinça e faça uma incisão com uma tesoura cirúrgica para expor o útero.
3. Remova cuidadosamente o útero e coloque-o na placa de Petri previamente preparada no gelo.
4. Usando uma tesoura cirúrgica sob o capuz laminar em RT, remova cuidadosamente os embriões do útero. Remova todos os resíduos placentários dos embriões com uma pinça e coloque-os em uma nova placa de Petri de 10 cm cheia de tampão de Dulbecco.
5. Usando pinças de dissecação ou agulhas, corte o traseiro da cabeça dos locais marcados com setas pretas na Figura 1A. Retire o pedaço cortado do resto do embrião (Figura 1B).
6. Coloque a parte posterior da peça cortada em direção ao observador (Figura 1C) e corte-a suavemente da caudal para o cranial (Figura 1D). De 0,5 mm abaixo da abertura craniana, corte uma região de 2 mm²–3 mm², mostrada na Figura 1E.
7. Colete o assoalho ventral do mesencéfalo (ver Figura 1F) em um tubo de microcentrífuga vazio de 1,5 mL. Mantenha o tubo da microcentrífuga no gelo até que todos os assoalhos do mesencéfalo estejam coletados nele.
   nota: Alternativamente, os assoalhos do mesencéfalo podem ser coletados com uma micropipeta de 1 mL após a dissecção de todos os cérebros embrionários.

3. Estabelecimento de culturas primárias do mesencéfalo embrionário de embriões de camundongos E13.5 em formato de placa de 96 poços

1. Após a coleta do assoalho do mesencéfalo de todos os embriões no mesmo tubo de 1,5 mL, remova o tampão de Dulbecco residual e lave os pedaços de tecido três vezes com 500 μL de solução salina balanceada de Hank sem Ca²⁺, Mg²⁺ (HBSS).
2. Remova o HBSS e adicione 500 μL de tripsina a 0,5% ao tubo. Incubar a 37 °C durante 30 min.
3. Durante a incubação, aqueça 1,5 mL de soro fetal bovino (FBS) a 37 ° C, adicione 30 μL de DNase I ao FBS e misture. Além disso, polir a ponta de uma pipeta de vidro siliconizada. Certifique-se de que o orifício não tenha bordas afiadas e tenha aproximadamente o mesmo tamanho de uma ponta de micropipeta de 1 mL.
   NOTA: Como alternativa, uma ponta de micropipeta de baixa adesão de 1 mL pode ser usada para trituração. No entanto, as pipetas de vidro siliconizadas parecem dar os melhores resultados.
4. Assim que a incubação na etapa 3.2 terminar, adicione 500 μL da mistura FBS / DNase ao tecido parcialmente digerido. Use a pipeta de vidro para triturar o tecido na mistura FBS / tripsina. Triturar até que os tecidos se dissociem em partículas minúsculas e pouco visíveis. Evite bolhas durante a trituração.
5. Deixe as partículas restantes precipitarem no fundo do tubo da microcentrífuga por gravidade. Sem pipetar o precipitado no fundo, recolher o sobrenadante para um tubo cónico vazio de polipropileno de 15 ml.
6. Dilua FBS/DNase I da etapa 3.3 (98:2) com 1.000 μL de HBSS para obter FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). Misture pipetando para cima e para baixo. Adicione 1.000 μL da nova mistura às partículas restantes no tubo da microcentrífuga. Triture novamente e repita a etapa 3.5.
7. Repita a etapa anterior mais uma vez para usar todos os FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
8. Uma vez que todo o sobrenadante é coletado dentro do tubo de 15 mL (das etapas 3.5, 3.7 e 3.8), use uma centrífuga de mesa para girar o sobrenadante (~ 3 mL) a 100 x g, por 5 min. Remova o sobrenadante sem tocar nas células peletizadas na parte inferior.
9. Lave o pellet celular adicionando 2 mL de DPM ao tubo e gire-o a 100 x g por 5 min. Remova o sobrenadante e repita a lavagem 2x para minimizar os detritos nas células peletizadas.
   NOTA: Sempre use DPM fresco e aquecido para os neurônios cultivados. Para as etapas de lavagem, o DPM não tem de ser fresco, mas deve ser pré-aquecido a 37 °C.
10. Diluir as células com DPM fresco e quente e transferi-las para um tubo de microcentrífuga. A quantidade de DPM para diluição depende do número de embriões usados para dissecção de tecido. Por exemplo, use 150 μL de DPM para diluir as células obtidas de dez embriões.
11. Transfira 10 μL de células em DPM para um tubo de microcentrífuga. Misture-os com 10 μL de corante azul de tripano a 0,4%. Conte células vivas (ou seja, azul de tripano negativo) usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado.
    NOTA: Use 30.000 células para revestimento por poço para obter ~ 1.000 neurônios de dopamina por poço. Se a densidade celular for superior a ~ 30.000 células por 6 μL, dilua ainda mais as células com DPM antes do plaqueamento para que o volume de semeadura não seja inferior a 6 μL.
12. Sem tocar no fundo dos poços, remova o DPM das micro ilhas criadas na etapa 1.6.
13. Para obter densidade celular reprodutível em cada poço, misture as células por pipetagem suave antes de plaquear no poço. Com uma micropipeta de 1 a 10 μL, adicione 6 μL de células ao meio do poço no local de cada micro ilha anterior.
14. Encha os poços vazios nas bordas da placa com 150 μL de água ou 1x PBS para minimizar a evaporação dos poços contendo culturas neuronais. Incubar a placa numa incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ durante 1 h.
15. Após 1 h, remova a placa da incubadora, adicione 100 μL de DPM em cada poço com células e coloque-a de volta na incubadora.
16. Dois dias após o plaqueamento (dia in vitro 2, ou DIV2), remova 25 μL e adicione 75 μL de DPM fresco para trazer o volume final do meio para 150 μL e evitar a evaporação o máximo possível.
17. Troque metade do meio por DPM fresco (ou seja, remova 75 μL e adicione 75 μL de DPM fresco) em DIV5. Não execute nenhuma alteração de mídia após o DIV5.

4. Indução de agregados de α-sinucleína em neurônios dopaminérgicos embrionários primários por semeadura com fibrilas pré-formadas

Após qualquer trabalho com fibrilas pré-formadas (PFFs) de α-sinucleína), limpe a coifa laminar ou qualquer equipamento que possa ter entrado em contato com as PFFs com dodecil sulfato de sódio (SDS) a 1% e, em seguida, com etanol a 70%.

1. Antes do experimento, dilua os PFFs com 1x PBS até uma concentração final de 100 μg/mL. Sonicar os PFFs diluídos em tubos de microcentrífuga com um sonicador de banho em alta potência com resfriamento em banho-maria a 4 °C por 10 ciclos, 30 s ON/30 s OFF.
   nota: É fundamental que as fibrilas sejam devidamente sonicadas para gerar fragmentos de ~ 50 nm de comprimento. O tamanho dos PFFs sonicados pode ser medido diretamente a partir de imagens de microscópio eletrônico de transmissão de PFFs corados. A sonicação pode ser alcançada conforme descrito acima em um sonicador de banho de alta potência. Alternativamente, um sonicador de ponta pode ser usado. Os PFFs sonicados podem ser armazenados a -80 °C em pequenas alíquotas para evitar vários ciclos de congelamento/descongelamento.
2. No DIV8, adicione 3,75 μL de 100 μg/mL de PFFs por poço aos 150 μL de meio no poço até uma concentração final de 2,5 μg/mL. Use a mesma quantidade de 1x PBS para o grupo de controle.
3. Prepare paraformaldeído a 4% (PFA) em 1x PBS e armazene as alíquotas a -20 °C. Para isso, siga os passos abaixo.
   NOTA: O PFA é tóxico; use máscara e luvas durante o preparo, trabalhe sempre sob capuz laminar e descarte todos os resíduos sólidos e líquidos de PFA de acordo com as instruções da instituição.
   1. Aqueça 500 mL de 1x PBS em um recipiente de 1 L. Coloque uma barra de agitação no recipiente e coloque o recipiente em um agitador magnético com função de aquecimento. Ajuste a temperatura entre 40–60 °C para evitar a fervura, mantendo a solução quente.
   2. Meça 20 g de pó de PFA sob o capô em um recipiente medidor de plástico descartável. Adicione cuidadosamente o pó de PFA no recipiente cheio de 1x PBS. Comece a mexer a solução.
   3. Adicione 200 μL de hidróxido de sódio 5 M na solução e continue mexendo por ~ 15 min até que o PFA se dissolva completamente.
   4. Depois que a solução parecer homogênea, adicione 168 μL de cloreto de hidrogênio 5 M para equilibrar o pH para ~ 7. Verifique o pH com tiras indicadoras de pH descartáveis com cores fixas.
   5. Retirar o recipiente do aquecedor e deixá-lo arrefecer até à temperatura de saída. Filtrar a solução e a alíquota para armazenamento a -20 °C. Descongelar as alíquotas à temperatura de injecção antes da utilização e não voltar a congelar depois.
4. No DIV15, remova todos os meios dos poços pipetando. Adicione 50 μL de PFA a 4% a cada poço para fixar as células e incubar por 20 min em RT. Após a incubação, remova o PFA dos poços e adicione 100 μL de 1x PBS a cada poço para lavar as células. Remova 1x PBS e lave 2x mais.
5. Deixe 100 μL de 1x PBS em cada poço para evitar a secagem. Conservar a placa a 4 °C até que a imunoquímica seja realizada.

5. Coloração imunofluorescente e imagem automatizada de neurônios dopaminérgicos embrionários primários em placas de 96 poços

1. Remova 1x PBS e permeabilize as células adicionando 100 μL de Triton X-100 a 0,2% em PBS (PBST) por poço e incubando em RT por 15 min.
2. Remova o PBST e adicione 50 μL de soro de cavalo normal (NHS) a 5% por poço ao PBST. Para bloquear a atividade inespecífica do antígeno, incubar em RT por 1 h.
3. Dilua os anticorpos primários contra tirosina hidroxilase (TH) e pS129-αsyn (1:2.000) em 5% de NHS em PBST. Adicione 50 μL de anticorpos diluídos a cada alvéolo e incube durante a noite a 4 °C.
4. Remova os anticorpos e adicione 100 μL de 1x PBS a cada poço para lavar as células. Remova 1x PBS e repita a lavagem 2x.
5. Para evitar o branqueamento de moléculas fluorescentes, comece a trabalhar em condições mínimas de luz. Diluir os anticorpos secundários marcados com fluorescência (1:400) em PBST. Adicione 50 μL de anticorpos diluídos a cada poço e incube em RT por 1 h.
6. Remova a solução de anticorpos e adicione 100 μL de 1x PBS a cada poço para lavar as células. Remova 1x PBS e repita a lavagem 2x.
7. Remova 1x PBS, adicione 50 μL de 200 ng/mL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por poço para corar os núcleos das células cultivadas e incube em RT por 10 min.
8. Lave as células 3x com 100 μL de 1x PBS por 5 min cada. Mantenha 100 μL de 1x PBS em cada poço após a última lavagem. Cubra a placa com papel alumínio e guarde-a a 4 °C até a obtenção de imagens.
9. Imagem de neurônios dopaminérgicos embrionários primários em uma placa de 96 poços com um scanner de placa de alto conteúdo (consulte a Tabela de Materiais) equipado com uma objetiva de 10x.
10. Ajuste as configurações com base nas especificações da placa de 96 poços, como tipo de placa, fabricante, tamanho, distância entre poços, bem como tipo e quantidade de meio.
11. Selecione a área de imagem do poço para cobrir todas as células em uma micro ilha. Escolha um exemplo bem para ajustar o foco automático. Baseie o foco inicial no DAPI.
12. Calibre o tempo de aquisição para cada canal fluorescente com base na intensidade da coloração nos poços de controle. Ajuste os parâmetros para que, em poços de controle tratados com PFF, seja possível distinguir claramente as células de dopamina que abrigam agregados de pS129-αsyn no soma celular, permitindo a quantificação inequívoca de células pS129-αsyn positivas e pS129-αsyn negativas.
    nota: Os poços que não contêm PFFs não devem ter nenhuma coloração para pS129-αsyn; portanto, esses poços podem ser usados como controle negativo para ajustar a intensidade de pS129-αsyn.
13. Visualize todos os poços selecionados com uma objetiva de 10x simultaneamente para todos os canais com coloração de imunofluorescência com exatamente os mesmos parâmetros.
14. Opcionalmente, marque as inclusões de α-sinucleína em um subconjunto dos poços com anticorpos específicos para α-sinucleína filamentosa para confirmar que as alterações no número de inclusões positivas para pS129-αsyn refletem a redução no acúmulo de proteínas em vez da inibição da fosforilação ou desfosforilação de pS129-αsyn.
15. Repita a etapa 5.3, substituindo o anticorpo pS129-αsyn pelo anticorpo filamentar de α-sinucleína (1:2.000). Imagem da α-sinucleína agregada corada como na etapa 5.13.

Results

Figura 1: Dissecção do assoalho do mesencéfalo do embrião de camundongo E13.5. (A) Os locais de corte no quarto traseiro da cabeça são marcados com setas pretas e linhas tracejadas brancas. (B) O pedaço foi removido do resto do embrião. A peça removida é circulada. (C) A peça foi girada 90° para ficar de frente para o posterior em direção ao observad...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,4% de mancha azul de tripano	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA	15250061
Tubo de polipropileno CELLSTAR de 15 ml	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha	188261
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA	10236276001
5 M HCl	N/A	N/A	Media kitchen, Instituto de Biotecnologia, Universidade de Helsínquia
5 M NaOH	N/A	N/A	Media kitchen, Instituto de Biotecnologia, Universidade de Helsínquia
Placa de visualização de 96 poços (preta)	PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, EUA	6005182
99,5% de etanol (EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, Finlândia	N/A
Fluido Siliconizante AquaSil	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA	TS-42799
Tubo de microcentrífuga autoclavado de 1,5 ml	N/A	N/A	Media kitchen, Instituto de Biotecnologia, Universidade de Helsínquia
Dispositivo de sonicação Bioruptor	Diagenode, Liège, Bélgica	B01020001
Ca2+, solução salina balanceada de Hank+ livre de Mg2+ (HBSS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA	14175-053
Pacotes de software CellProfiler e CellAnalyst	N/A	N/A	Software de código aberto gratuito
Centrífuga 5702	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha	5702000019
Incubadora de CO2	HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA	N/A
Câmara de contagem	BioRad Inc., Hércules, Califórnia, EUA	1450015
Microscópio de ultra-alta resolução DeltaVision com mesa de ar e gabinete	GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, EUA	29254706
Desoxirribonuclease-I (Dnase I)	Roche, Basel, Suíça	22098700
D-glicose	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA	G8769
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA	21331–020
rato anti-rato para burros AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA	A21202
anti-coelho para burros AlexaFluor 647	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA	Resposta A31573
anti-ovelha para burros AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA	Rolamento A11015
Amortecedor de Dulbecco	N/A	N/A	Media kitchen, Instituto de Biotecnologia, Universidade de Helsínquia
Soro fetal bovino (FBS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA	10500056
Barra de agitação de PTFE de economia simples da Fisherbrand	fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA	11507582
Sistema de imagem automatizado ImageXpress Nano	Molecular Devices, San Jose, Califórnia, EUA	N/A
L-glutamina	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA	25030–032
hidroxilase monoclonal de camundongo anti-tirosina	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha	MAB318
Suplemento N2	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA	17502–048
Soro Normal para Cavalos	Vector Laboratories Inc., Burlingame, Califórnia, Estados Unidos	S-2000
paraformaldeído (PFA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA	158127
pó de paraformaldeído, 95%	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA	158127
Tiras indicadoras de pH fixo, com cores fixas	Macherey-Nagel, Düren, Alemanha	Rolamento 92110
Tampão de fospoato salino (PBS)	N/A	N/A	Media kitchen, Instituto de Biotecnologia, Universidade de Helsínquia
poli-L-ornitina	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA	Pág. 4957
Primocin	InvivoGen, San Diego, Califórnia, EUA	formiga-pm-1, formiga-pm-2
Filamento monoclonal de coelho anti-alfa-sinucleína	Abcam, Cambridge, Reino Unido	AB209538
anti-fosfa-serina129-alfa-sinucleína monoclonal de coelho	Abcam, Cambridge, Reino Unido	AB51253
RCT Basic, Agitador Magnético IKA	IKA-Werke® GmbH, Staufen, Alemanha	Rolamento 3810000
fator neurotrófico derivado da glia humana recombinante (hGDNF)	PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA ou Prospec, Ness-Ziona, Israel	450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)
Fibrilas pré-formadas de alfa sinucleína de camundongo recombinante (PFFs)	N/A	N/A	Presente do colaborador, Prof. Kelvin C Luk
Sistema de estereomicroscópio de pesquisa	Olympus Corporation, Tóquio, Japão	SZX10
anti-tirosina hidroxilase policlonal de ovelha	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha	AB1542
TC 20 Contador de Células Automatizado	BioRad Inc., Hércules, Califórnia, EUA	1450102
Tritão X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA	11332481001
tripsina	MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China	Rolamento 2199700