Gerando uma oclusão da artéria cerebral média em um filhote de rato para induzir isquemia cerebral local

Resumo

Fonte: Larpthaveesarp, A., et. al. Modelo transitório de oclusão da artéria cerebral média de acidente vascular cerebral neonatal em ratos P10. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o estabelecimento do modelo de oclusão da artéria cerebral média em um filhote de rato. A artéria carótida interna (ACI) é exposta e uma ligadura é fixada para restringir a inundação do sangue. Um ocluído é inserido através da ACI para atingir a Artéria Cerebral Média. O filhote é então autorizado a se recuperar antes de uma análise mais aprofundada.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Oclusão da Artéria Cerebral Média

1. Pese o filhote e certifique-se de que ele tenha o peso adequado (19-21 g). Anestesie o filhote em isoflurano a 3% em oxigênio a 100% (O₂) e certifique-se de que não haja resposta a um beliscão no pé. Mantenha a temperatura da superfície corporal entre 35,5 °C e 37 °C com o uso de uma almofada de aquecimento durante a fase cirúrgica.
2. Prenda o animal em decúbito dorsal com fita adesiva nas regiões dos ombros. Usando cotonetes estéreis, esfregue a área cervical anterior com uma solução de iodopovidona seguida de um cotonete de etanol a 70% em água bidestilada
3. Infiltre localmente a bupivacaína a 0,25% no local da incisão planejada. Usando um estereoscópio, faça uma incisão cervical anterior de 5 a 7 mm na linha média para expor a artéria carótida comum (CCA). Coloque 2-4 afastadores para manter a cavidade aberta e a artéria exposta.
4. Localize a artéria carótida interna (ACI), a artéria occipital (OA) e a artéria carótida externa (ECA). Limpe as artérias para obter uma visão clara. Tenha cuidado para não perturbar o nervo vago.
   NOTA: Para filhotes operados de forma simulada, a incisão é deixada aberta e as artérias são expostas, após o que a incisão é suturada fechada. O tempo total de anestesia é equivalente ao da cirurgia de oclusão.
5. Corte 1,5 cm de fio de sutura trançado de seda 6-0. Destrance a sutura, puxando fios simples. Certifique-se de que os fios individuais estejam limpos e não desgastados.
   NOTA: Se necessário, alise as pontas desgastadas mergulhando o fio único em água estéril e limpando o fio com pontas de fórceps.
6. Enquanto segura o fio de sutura com uma pinça de 45 graus, mova a pinça em um movimento de arco de varredura para passar por baixo da ACI de modo que as pontas da pinça surjam entre a ACI e a OA.
   NOTA: Se a dissecção for bem feita, esta etapa será relativamente fácil. Se a ACI e a OA estiverem se tocando, tome cuidado para não romper as artérias ao usar a pinça para isolar a ACI. Se ocorrer sangramento, aplique pressão na artéria com a pinça até que o sangramento pare. Absorva o sangue com um cotonete estéril.
7. Pegue a extremidade do fio de sutura que é segurado pela pinça e puxe-a para que a extremidade seja de fácil acesso. Solte o fio da pinça e retire-o de baixo do ICA, invertendo o movimento na etapa 1.5 (Figura 1A).
8. Amarre uma ligadura temporária ao redor do ICA na base, mais próximo de onde ele se separa do CCA.
   NOTA: É importante dar o nó de forma que a ponta do fio que será puxado para remover o nó seja longa o suficiente (maior que 1 mm, menor que 3 mm) para agarrar facilmente com uma pinça, garantindo que haja uma quantidade adequada de fio de sutura do outro lado do nó para retração.
9. Retraia cuidadosamente o ACI lateralmente e use um clipe para prender o fio ao excesso de pele próximo à região da axila no lado oposto à incisão. Certifique-se de que este fio retrátil esteja esticado o suficiente para interromper o fluxo sanguíneo antes de prosseguir para a próxima etapa para minimizar o risco de sangramento descontrolado. Observe que a artéria é plana e pálida.
   NOTA: Não retraia demais, pois isso pode causar uma ruptura parcial ou completa do ICA. A retração pode ser ajustada imediatamente antes de fazer a arteriotomia, puxando o fio do lado oposto ao clipe.
10. Use uma pinça de 45° para segurar outro fio de sutura não trançado e enrole-o sob e ao redor do ICA, como na etapa 1.5. Posicione esta fita lateralmente à fita de retração (Figura 1B).
    NOTA: Esta etapa também pode ser feita antes da retratação. Se não tiver certeza sobre a qualidade da retração, esse nó pode ser amarrado muito frouxamente antes da próxima etapa.
11. Corte uma arteriotomia de 0,2 mm a meio caminho entre as ligaduras amarradas e desamarradas, errando mais perto da ligadura amarrada.
    NOTA: O sangue remanescente na artéria ligada pode esvaziar através da arteriotomia, mas não deve exceder 5 μL. Se o sangramento persistir, puxe cuidadosamente o fio de retração para aumentar a retração, com cuidado para evitar danificar a artéria devido à tensão excessiva.
12. Usando uma régua métrica, meça a sutura de oclusão e corte a sutura com uma margem extra de 2-3 mm para remover o oclusor durante a reperfusão. Segure o oclusor com uma pinça de 45 graus e use uma pinça reta para criar uma curva no comprimento apropriado para alcançar o MCA, marcando um ponto de parada para o avanço.
    NOTA: Um comprimento de oclusão de 10 mm da extremidade da ponta de silicone até a dobra é usado para filhotes de ratos pós-natais ou P-10 Sprague Dawley ou Long Evans nesta faixa de peso.
13. Usando uma pinça de 45°, alimente a sutura de oclusão de náilon revestida de silicone na arteriotomia e avance a sutura para a dobra que marca a distância pré-determinada até a ACM (Figura 1C). Certifique-se de que o avanço seja suave; Pare imediatamente o avanço se sentir resistência. Durante o avanço, aponte a sutura em uma direção paralela ao CC/ECA, em direção à cabeça.
    NOTA: Se a sutura for avançada dorsalmente em direção à coluna vertebral do animal, ela pode correr para a artéria pterigopalatina (PTA). Se a resistência for sentida após 3-5 mm de avanço, a sutura atingiu a junção PTA. Recue o oclusor para fora da artéria até que a cabeça de silicone esteja perto da arteriotomia antes de ajustar a direção de avanço. Não é necessário remover completamente o oclusor da arteriotomia.
14. Prenda o oclusor amarrando uma ligadura temporária usando o fio da etapa 1.10 (Figura 1D).
15. Remova o clipe retrator. Apare os fios de ambas as ligaduras temporárias para que o fio do nó que é puxado para remover o nó seja fácil de segurar com uma pinça reta e seja mais longo do que o fio que é puxado para apertar o nó.
    NOTA: Os fios devem ser curtos o suficiente para que não se enredem na cavidade após o fechamento.
16. Remova os afastadores e feche a cavidade usando seda trançada 6-0 para criar três a quatro suturas interrompidas.
17. Remova o filhote da anestesia e coloque-o em uma almofada de aquecimento ao ar ambiente. Monitore o filhote até que ele recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal e certifique-se de que ele se recuperou totalmente antes de devolvê-lo à barragem. Certifique-se de que o filhote mantenha uma temperatura da superfície corporal entre 35,5 °C e 37 °C.

Resultados

Figura 1: Imagens cirúrgicas ao vivo do procedimento tMCAO. (A) O primeiro fio de sutura é enrolado ao redor do ICA, conforme detalhado na etapa 1.6. (B) A primeira ligadura temporária é amarrada e a ACI é retraída. O segundo fio de sutura é enrolado ao redor do ICA, lateral ao primeiro fio de sutura, conforme detalhado na etapa 1.9. (C) A sutura de ...

Materiais

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Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Isoflourane	Henry Schein	50033	Anesthetic, at 3%
Trinocular Surgioscópio	World Precision Instruments	PSMT5N
Almofada de aquecimento	Sunbeam	000731-500-000	Configuração
IR Thermometer	Extech Instruments	72-5270
Kit de retração para pequenos animais	Fine Science Tools	18200-20
CermaCut Scissors	Fine Science Tools	14958-09
#5SF Dumont Forceps	Fine Science Tools	112522-00	2x
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35	2x
B-2 Micro Clamp	Fine Science Tools	00398-02
Forcepts for Clamp Application	Fine Science Tools	00072-14
Micro Vannas Scissors	Fine Science Tools	15000-03	2mm de ponta
Oclusion Sutures	Doccol	602123PK10	701712PK5Re
Ruler	Fine Science Tools
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSutura	Ethicon	769G
Euthasol	Virbac	710101	0.22 ml/kg
Aplicadores com Ponta de Algodão	Henry Schein	100-9249
Laboratory Tape	VWR	89097-990