Baseados em células de Ensaio de cálcio para Médio a High Throughput Screening de Funções TRP usando FlexStation Canal 3

Summary

Este vídeo fornece um protocolo detalhado para o estudo do perfil farmacológico dos direitos humanos TRPA1 canais usando FlexStation 3. O protocolo abrange detalhes de preparação das células, carregando corante e operação do leitor de microplacas, FlexStation 3.

Abstract

FlexStation Dispositivos Molecular '3 é uma bancada modo multi-leitor de microplacas capaz de medição de fluorescência automatizado em multi-lamelas. É ideal para empresas de médio a alto rendimento telas em ambientes acadêmicos. Ele tem um módulo de transferência integrada de fluido equipado com uma pipeta multi-canal ea máquina lê uma coluna de cada vez para monitorar as mudanças de fluorescência de uma variedade de reagentes fluorescentes. Por exemplo, FlexStation 3 tem sido usado para estudar a função de Ca ^{2 +-permeável} canais iônicos e G receptores acoplados à proteína, medindo as mudanças de livre intracelular Ca ^{2 +} níveis. Transiente potencial receptor (TRP) canais são uma grande família de canais de comunicação não-seletivos que desempenham papéis importantes em muitas funções fisiológicas e fisiopatológicas. A maioria dos canais de cálcio TRP são permeáveis ​​e induzir o influxo de cálcio na ativação. Neste vídeo, demonstramos a aplicação de FlexStation 3 a estudar o perfil farmacológico do canal TRPA1, um sensor molecular para inúmeros estímulos nocivos. HEK293 células transitoriamente ou expressando estavelmente humana TRPA1 canais, cultivadas em placas de 96 poços, são carregados com um Ca ^{2 +} sensíveis ao corante fluorescente, Fluo-4, e em tempo real as mudanças de fluorescência nessas células são medidos antes e durante a aplicação de um agonista TRPA1 usando o modo FLEX do FlexStation 3. O efeito de um antagonista TRPA1 putativa também foi examinada. Dados são transferidos do software Pro SoftMax para construir relações concentração-resposta de TRPA1 ativadores e inibidores.

Protocol

1. Preparações de células em placas de 96 poços

Para HEK293 células transitoriamente trasfected com TRPA1 humana cDNA

1. HEK293 células são cultivadas para 1-2 dias em meio mínimo essencial de Dulbecco (DMEM), contendo 4,5 glicose mg / ml (Thermo Scientific, SH3002201), suplementado com inativado pelo calor de 10% de soro fetal bovino (Invitrogen, 16000-044), 50 unidades / ml de penicilina e estreptomicina 50 mg / ml (Invitrogen, 15140-163). No dia da transfecção, a densidade celular deve chegar a 70-90%.
2. Casaco de placas de 96 poços pipetando 50 ul poli-L-ornitina (Sigma P3655, 20 mcg / ml em água destilada est....

Discussion

Ca ^{2 +} intracelular desempenha um papel importante em muitas condições fisiológicas e patológicas, como a liberação de neurotransmissores (3), potencial de ação cardíaco (4), a contração da célula muscular (5), transdução de sinal celular (6-7), e morte celular excitotoxic ( 8). Medição de Ca ^{2 +} intracelular níveis ajuda a elucidar as alterações funcionais de Ca ^{2 +-permeável} canais na membrana plasmática ou organelas intracelulares ea contribuição de
Ca ^{+ 2} para os pr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
FlexStation 3	Os dispositivos moleculares	FLEX3
96-Bem, Pipetar Dicas FlexStation	Os dispositivos moleculares	9000-0912
Placas de 96 poços	Greiner Bio-one	655090
96-Bem Limpar plano placas inferior	Costar	3595
DMEM	Invitrogen	12430-104
Opti-MEM	Invitrogen	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Fluo-04:00	Invitrogen	F14202
PluronicF-127	Invitrogen	P3000MP
Poli-L-ornitina	Sigma	P36551
probenecid	Sigma	P8761
Albumina de soro bovino	Sigma	A9418