Preparação de plasma rico em plaquetas a partir de sangue periférico humano

Resumo

Este vídeo demonstra a preparação de plasma rico em plaquetas (PRP) de alta qualidade por meio da triagem da contagem de plaquetas, coleta e centrifugação de sangue e isolamento de plaquetas. Este PRP é usado em aplicações terapêuticas para regeneração e cicatrização de tecidos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Coleta de amostras

1. Rastreie os pacientes usando hemogramas preliminares para descartar trombocitopenia e estabelecer contagens de células basais. Para fazer isso, use um hemocitômetro de grau clínico para contagem de células. Certifique-se de que a contagem de plaquetas esteja acima de 150.000 células/μL.

2. Certifique-se de que o paciente esteja bem hidratado antes da coleta da amostra. Isso pode ser garantido pela inspeção visual da língua, turgor da pele e medição da pressão arterial.

3. Colete 100 mL de sangue venoso periférico da veia antecubital do paciente usando 2 seringas de 50 mL cheias de 5 mL de anticoagulante ácido-citrato-dextrose-adenina (ACDA) na proporção de 1:10. Incline as seringas coletadas para uma mistura adequada do anticoagulante para evitar a coagulação da amostra de sangue antes de prosseguir para a próxima etapa.
   NOTA: A coleta lenta de sangue pode resultar em mistura inadequada do sangue coletado com o anticoagulante e coagulação; portanto, use uma cânula mínima de 18G para coleta de sangue.

4. Transfira 100 mL de sangue nas seringas para tubos de centrifugação de fundo cônico de 15 mL com 10 mL em cada tubo.

2. Centrifugação e isolamento

1. Coloque os tubos de centrifugação em uma máquina de centrifugação de mesa de grau clínico mantida em temperatura ambiente em um ambiente estéril e execute a centrifugação suave inicial na velocidade de 100 x g por 15 min. O sangue anticoagulado se separa em três camadas, ou seja, glóbulos vermelhos na parte inferior, plasma na parte superior e camada amarelada no meio.

2. Pipetar a camada superior da amostra de três camadas de forma estéril utilizando uma agulha espinhal estéril de 18G e recolhê-la num tubo de centrifugação cónico inferior separado. Garantir tubos individuais para cada 10 mL de plasma coletado.
   NOTA: A decisão de incluir o revestimento leucocitário depende da natureza do plasma rico em plaquetas que estamos tentando isolar, que por sua vez depende da natureza de sua aplicação clínica. Se o PRP pobre em leucócitos for o produto desejado, evite incluir a camada de revestimento leucocitário, enquanto se o PRP rico em leucócitos for o produto desejado, a camada superior de plasma junto com o revestimento leucocitário é pipetada para a segunda rodada de centrifugação.

3. Submeta o plasma coletado em tubos de centrifugação de 15 mL com 10 mL de plasma cada para centrifugação em centrifugação a 1600 x g por 20 min. As plaquetas presentes no pellet de plasma na parte inferior do tubo de ensaio. Recolher o sobrenadante num tubo separado.

4. Pipete o pellet de plaquetas para uma seringa de 5 ml com a ajuda de uma agulha espinhal estéril de 18 G. Colete todos os tubos de ensaio com pellets em uma única seringa de 5 mL para aplicação.

5. Reconstituir o sedimento recolhido com volumes suficientes para uso clínico com o plasma sobrenadante no tubo de centrifugação após a segunda ronda de centrifugação.

3. Validação

1. Submeter o PRP final preparado à contagem de células usando hemacitômetro de grau clínico para calcular a contagem de plaquetas e calcular a contagem absoluta de plaquetas no PRP, gradiente de concentração de plaquetas alcançado ao longo da linha de base e eficácia de recuperação plaquetária do protocolo usando a seguinte fórmula.
   Contagem absoluta de plaquetas = contagem de plaquetas do PRP em μL x 1000 x volume de PRP em mL
   Gradiente de concentração de plaquetas =
   Eficiência da recuperação plaquetária =
   Por exemplo, 100 mL de sangue com uma contagem basal de plaquetas de 200.000 / μL é usado para preparação de PRP, e 5 mL de PRP com contagem final de plaquetas de 3.000.000 / μL são obtidos. Os parâmetros mencionados acima são calculados da seguinte forma:
   Contagem absoluta de plaquetas = 3.000.000 x 1000 x 5 = 15 bilhões de plaquetas
   Gradiente de concentração de plaquetas = 3.000.000 / 200.000 = 15
   Eficiência de recuperação de plaquetas = 3.000.000 x 1000 x 5 / 200.000 x 1000 x 100 = 75%

2. Garantir a eficiência de recuperação do protocolo através de ciclos repetidos. Um protocolo eficaz utilizado fornece um gradiente de concentração acima de 5 vezes a linha de base com eficiência de recuperação de >80%. Com base no uso desejado do volume de PRP, as contagens de plaquetas que precisam ser fornecidas podem ser tituladas de acordo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticoagulant Citrate Dextrose Solution IP	Fresenius Kabi, Índia	ACDAIP/L/A/19/00
BD Quincke Needle	Becton Dickinson, Espanha	405125	Seringa de 50ml 18G
DISPOVAN Seringas de 50ml	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd, Índia
DISPOVAN seringa de 5ml	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd, Índia
Tarsons de fundo cônico de tubo Spinwin	, Índia	546021
Sysmex XN-350	Sysmex Inc., EUA	XN 350
Table Top Clinical Centrifugation Machine	REMI, Índia	R-8C	4x4 rotor de saída de poço