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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pela revisão ética animal apropriada comité.
1. Triagem de seção para a presença de placas coradas com metoxi-X04
- Com a ajuda de um atlas cerebral de camundongo estereotáxico, selecione seções cerebrais contendo a região de interesse, por exemplo, o hipocampo CA1 como usado no presente exemplo. Coloque cada seção em um poço dentro de uma placa de cultura de 24 poços contendo solução crioprotetora suficiente para evitar que as seções sequem.
- Examine cada seção sucessivamente para evitar o ressecamento das seções usando o seguinte procedimento:
- Adicione uma gota de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma lâmina de microscópio com uma pipeta descartável e coloque a seção na gota.
- Examine a seção sob um microscópio fluorescente para identificar regiões contendo placas Aβ marcadas com metoxi-X04.
Nota:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > metoxi-X04 pode ser facilmente visualizado usando um filtro ultravioleta (UV) de fluorescência (excitação 340 - 380 nm).
- Capture imagens de regiões de interesse (ROI) em campo claro, bem como em modo de fluorescência sem mover a platina do microscópio, pois cada imagem deve mostrar a mesma região em ambos os campos para correlacionar a presença das placas diretamente com a região estrutural da seção de tecido.
- Salve e nomeie as imagens tiradas de acordo com o número do animal. Registre também o número do poço na placa e o campo das fotos tiradas. Por exemplo, Ex: 9978A1B; Número do animal: 9978; Número do poço: A1; Campo: Brilhante. Coloque a seção de volta em seu poço designado assim que a imagem for concluída.
Nota:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > No final, para cada seção examinada, são obtidas duas fotos, uma em campo claro e outra em campo UV. - Abra as duas imagens do mesmo ROI (uma em campo claro e outra em campo UV) na Imagem J e, usando o plug-in MosaicJ, alinhe as bordas das duas imagens e salve a imagem alinhada e combinada de acordo com o número do poço de onde veio.
- Salve a imagem em uma pasta separada com o número do animal em particular. Combine as imagens para identificar e localizar as placas na seção de tecido e tenha uma visão completa de toda a seção nos dois campos diferentes (brilhante e UV).
- Após a conclusão do processo de triagem, armazene as seções examinadas a -20 ° C em uma placa de cultura de 24 poços contendo crioprotetor até que a imunocoloração ou processamento adicional seja realizado.