Gravação e coloração justacelular para mapeamento preciso da atividade neural em um rato acordado

Resumo

Fonte: Moore, J. D., et al. Monitoramento justacelular e localização de neurônios únicos dentro de estruturas cerebrais subcorticais de ratos alertas e com a cabeça restrita. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra o método de gravação e coloração justacelular em um rato contido e acordado. O procedimento envolve o registro de sinais de neurônios e a injeção de corante para localizar com precisão o local de gravação. Essa técnica permite o mapeamento preciso da atividade neural para a estrutura anatômica do cérebro.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Monitoramento justacelular de unidades neuronais

1. Puxe o tubo capilar de quartzo em um extrator de micropipeta a laser de dióxido de carbono (consulte a seção Materiais) com diâmetros de ponta inferiores a 1 μm (Figura 2A).
   NOTA: Os parâmetros de aquecimento variam de acordo com o instrumento específico e o diâmetro do pescoço necessário varia de acordo com a estrutura cerebral de interesse. Para gravações em tálamo de rato, as micropipetas têm pescoços que variam de 5 a 7 mm.
2. Prenda a pipeta no lugar sob um microscópio de contraste de interferência diferencial (DIC) equipado com objetivas de longa distância de trabalho. Use massa de modelar para manter a pipeta no lugar no microscópio stage.
3. Mova lentamente um bloco de vidro (0,5 - 1 cm de espessura; um pedaço de vidro usado para fazer facas ultramicrotomáticas é conveniente) para o campo de visão com a ponta da pipeta. Usando o micromanipulador de platina, toque suavemente a ponta da pipeta no vidro, fazendo com que ele se quebre. Repita conforme necessário até que o diâmetro externo da ponta da pipeta esteja entre 1-3 μm (Figura 2B, C). Certifique-se de que essas micropipetas tenham impedâncias entre aproximadamente 5-15 MΩ.
4. Prepare solução salina extracelular (NaCl 135 mM, KCl 5,4 mM, CaCl 1,8 mM₂, 1 mM MgCl₂, HEPES 5 mM (ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanossulfônico), pH 7,2 com NaOH) e adicione 2% (p/v) Chicago Sky Blue. Encha a extremidade traseira da pipeta com a solução usando uma seringa com uma agulha de 30 G ou menos. Alternativamente, para marcação justacelular de célula única, adicione 2% (p / v) de neurobiotina ou dextrana amina biotinilada (BDA-3000 ou BDA-10000) à solução salina no lugar de Chicago Sky Blue.
5. Coloque o rato dentro da meia de pano dentro do tubo rígido em um gabarito experimental apropriado (Figura 1). Aguarde no mínimo 72 horas após a cirurgia antes de colocar o animal no gabarito do encosto de cabeça. Aperte o cordão ao redor do esterno superior, em vez do pescoço, para evitar a obstrução das vias aéreas. Se a respiração parecer difícil ou obstruída, afrouxe o cordão ou mova-o posteriormente. Execute este procedimento enquanto o rato está alerta.
6. Prenda a placa de retenção da cabeça no rato à peça correspondente no gabarito. Para fazer isso, primeiro prenda a placa do encosto de cabeça no lugar e, em seguida, prenda-a usando um parafuso 4-40. Certifique-se de esperar até que o animal esteja calmo para evitar a aplicação de torque excessivo na cabeça. Em seguida, coloque uma porca 8-32 no parafuso de retenção da cabeça que está implantado no rato. Em seguida, aparafuse uma haste rosqueada de aço inoxidável no parafuso principal. Fixe a haste no gabarito experimental de forma que possa ser apertada no lugar (Figura 1).
   NOTA: Prender o animal com o parafuso de cabeça, bem como com a placa de apoio de cabeça, minimiza a flexão do aparelho e melhora a estabilidade da gravação. Na maioria dos casos, a gravação pode começar no primeiro dia em que o animal é contido na cabeça. No entanto, se o animal se mexer excessivamente ou vocalizar, forneça um dia de treinamento de habituação com contenção de cabeça antes de iniciar qualquer gravação. Nesse caso, deixe o animal no gabarito por 15 min e depois coloque-o de volta na gaiola. Repita esta etapa no dia seguinte e continue com o protocolo.
7. Abra a câmara de gravação e remova o gel de silicone. Se o tecido voltou a crescer na craniotomia, limpe-o com uma pinça fina.
8. Conecte a pipeta ao micromanipulador motorizado e conecte o headstage pré-amplificador.
   NOTA: Na presente demonstração, um pequeno circuito de relé no cabeçote stage alterna entre os fios condutores do amplificador e uma fonte de corrente externa com alta conformidade(Figura 3A-C). Observe que alguns amplificadores têm uma fonte de alta conformidade integrada apropriada.
9. Use o micromanipulador motorizado para mover a ponta da pipeta para a marca identificada estereotaxicamente na câmara de gravação. Anote as coordenadas deste local. Tenha cuidado para não quebrar a ponta da pipeta no crânio.
10. Mova a pipeta para o local de registro desejado nos eixos ântero-posterior e mediolateral. Em seguida, avance a pipeta ventralmente através da dura-máter até que esteja aproximadamente 500 μm dorsal do local de registro pretendido.
11. Avance lentamente a pipeta enquanto ouve eventos de pico em um monitor de áudio do ampvol lificadotage gravado entre a ponta da pipeta e o fio de referência. Uma vez identificados os eventos de pico, continue a mover a pipeta de 0 a 100 μm até que sejam observadas deflexões de tensão positivas superiores a aproximadamente 500 μV.
    NOTA: A resistência do eletrodo aumentará por um fator de aproximadamente 1,5-10 quando isso ocorrer.
12. O registro deve começar assim que uma unidade for isolada, juntamente com todas as outras medidas comportamentais e fisiológicas de interesse. Na presente demonstração, os movimentos da vibrissa autogerados são monitorados com videografia de alta velocidade (consulte a seção Materiais ).
13. Para rotular o local de gravação, troque os fios do eletrodo para conectar à fonte de corrente. Existem várias maneiras de fazer isso, usando um circuito de relé(Figura 3A-C), uma fonte de corrente embutida no amplificador ou manualmente(Figura 3D). Passe -4 μA com pulsos de 2 segundos a 50% do ciclo de trabalho por 4 min para injetar iontoforeticamente Chicago Sky Blue através da pipeta.
14. Mate e perfunda o animal após vários procedimentos de rotulagem de acordo com a prática padrão. Corte o cérebro e contra-core conforme necessário para identificar a localização anatômica do local de registro. Contra-core o tecido para reatividade da citocromo oxidase. Alternativamente, identifique os depósitos Chicago Sky Blue usando microscopia de fluorescência.
    NOTA: Para diferenciar com precisão as diferentes unidades rotuladas, é importante que todas as etiquetas sejam feitas com a mesma pipeta no mesmo dia, sem desapertar a pipeta entre as etiquetas. Nesse caso, os locais de registro podem ser diferenciados por suas localizações relativas na histologia post-hoc, juntamente com as coordenadas do manipulador anotadas de cada local. Para uma identificação inequívoca, marque os rótulos a pelo menos 200 μm de distância um do outro e não mais do que 3-5 rótulos por região do cérebro.

Resultados

Figura 1: Gabarito experimental. Diagrama de rato no gabarito mecânico para experimentos de monitoramento eletrofisiológico e comportamental. O gabarito utiliza a barra e a placa

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ketaset (Cetamina HCl)	Fort Dodge	N/A
Anased (solução de xilazina)	Lloyd Laboratories	N/A
Betadyne (Povidona-Iodo)	CVS Pharmacy	269281
Loctite 495	Grainger Industrial Supply	4KL86	20-40 cp cianoacrilato
Vetbond	3M	1469SB
Grip cimento em pó	Dentsply Intl	675571	Para a base da câmara de gravação
Grip cimento líquido	Dentsply Intl	675572	Para a base da câmara de gravação
Gel de silicone	Dow Corning	Mar-80
Pó acrílico para reparo de dentadura a jato	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	Para fixar o aparelho de encosto de cabeça ao crânio
Ortho-Jet Líquido de resina acrílica ortodôntica de cura rápida	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	Para prender o aparelho de encosto de cabeça ao crânio
Chicago azul celeste	Sigma	C8679
Paraformaldeído	Sigma	158127	Para perfusão e fixação tecidual
Solução salina tamponada com fosfato	Sigma	P3813	Para perfusão e fixação tecidual
Citocromo C	Sigma	C2506
Diaminobenzidina	Sigma	D5905
Meias de rato	costurar elegante (San Diego, CA)	N / A
tubo de PVC 2 1/2 "	US Plastic Co.	34108
Pinos e soquetes D subminiatura	TE Connectivity	205089-1
Fio de música de aço inoxidável 0.010" de diâmetro	Precision Brand Products, Inc.	21010
Quadro de retenção estereotáxico	Kopf Instruments	Modelo 900
Barras de ouvido estereotáxicas	Kopf Instruments	Modelo 957
Manipulador estereotáxico	Kopf Instruments	Modelo 960
Broca de 1/2 mm Henry	Schein	100-3995
Broca odontológica Quiet-Air Midwest	Dental	393-1600
Aço inoxidável 0-80 1/8" parafuso	Fixador superstore 247438
tubo de centrífuga de 0,2mL	Fisher Scientific	05-407-8A
Barra de fixação de cabeça personalizada	UCSD SIO Machine Shop	N/A
Pós-braçadeira de ângulo reto	Newport	MCA-1
8-32 3/4" parafuso	Fixador Superstore	240181
4-40 1/4 "parafuso	Fixador Superstore	239958
Tubo capilar de quartzo	Sutter Instruments	QF-100-60-10
Micromanipulador motorizado	Sutter Instruments	MP-285
Amplificador de microeletrodo	Molecular Devices	Multiclamp 700B	Parte alternativa: Molecular Devices Axoclamp 900A
Microeletrodo cabeça do amplificador estágio	Molecular Devices	CV-7B	Parte alternativa: HS-9Ax10 com Molecular Devices Axoclamp 900A
Estimulador de pulso isolado	A-M Systems	Modelo 2100	Parte alternativa: HS-9Ax10 com Molecular Devices Axoclamp 900A
Monitor de áudio	Radio Shack	32-2040
Fio de chumbo de eletrodo	Fio Cooner	NEF34-1646
Relé para amplificador de estágio principal	Tecnologia COTO	#2342-05-000	opcional) Usado com uma placa de circuito impresso feita sob medida (UCSD Physics Electronics Shop), Figura 6A-C
Câmera de vídeo digital	Basler	A602fm
Suporte de pipeta	Warner Instruments	#MEW-F10T
Placa de suporte de cabeça personalizada	UCSD SIO Machine Shop	N/A

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