Gravação e coloração justacelular para mapeamento preciso da atividade neural em um rato acordado

Abstract

Fonte: Moore, J. D., et al. Monitoramento justacelular e localização de neurônios únicos dentro de estruturas cerebrais subcorticais de ratos alertas e com a cabeça restrita. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra o método de gravação e coloração justacelular em um rato contido e acordado. O procedimento envolve o registro de sinais de neurônios e a injeção de corante para localizar com precisão o local de gravação. Essa técnica permite o mapeamento preciso da atividade neural para a estrutura anatômica do cérebro.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Monitoramento justacelular de unidades neuronais

1. Puxe o tubo capilar de quartzo em um extrator de micropipeta a laser de dióxido de carbono (consulte a seção Materiais) com diâmetros de ponta inferiores a 1 μm (Figura 2A).
   NOTA: Os parâmetros de aquecimento variam de acordo com o instrumento específico e o diâmetro do pescoço necessário varia de acordo com a estrutura cerebral de interesse. Para gravações em tálamo de rato, as micropipetas têm pescoços que variam de 5 a 7 mm.
2. Prenda a pipeta no lugar sob um microscópio de contraste de interferência diferencial (DIC) equipado com objetivas de longa distância de trabalho. Use massa de modelar para manter a pipeta no lugar no microscópio stage.
3. Mova lentamente um bloco de vidro (0,5 - 1 cm de espessura; um pedaço de vidro usado para fazer facas ultramicrotomáticas é conveniente) para o campo de visão com a ponta da pipeta. Usando o micromanipulador de platina, toque suavemente a ponta da pipeta no vidro, fazendo com que ele se quebre. Repita conforme necessário até que o diâmetro externo da ponta da pipeta esteja entre 1-3 μm (Figura 2B, C). Certifique-se de que essas micropipetas tenham impedâncias entre aproximadamente 5-15 MΩ.
4. Prepare solução salina extracelular (NaCl 135 mM, KCl 5,4 mM, CaCl 1,8 mM₂, 1 mM MgCl₂, HEPES 5 mM (ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanossulfônico), pH 7,2 com NaOH) e adicione 2% (p/v) Chicago Sky Blue. Encha a extremidade traseira da pipeta com a solução usando uma seringa com uma agulha de 30 G ou menos. Alternativamente, para marcação justacelular de célula única, adicione 2% (p / v) de neurobiotina ou dextrana amina biotinilada (BDA-3000 ou BDA-10000) à solução salina no lugar de Chicago Sky Blue.
5. Coloque o rato dentro da meia de pano dentro do tubo rígido em um gabarito experimental apropriado (Figura 1). Aguarde no mínimo 72 horas após a cirurgia antes de colocar o animal no gabarito do encosto de cabeça. Aperte o cordão ao redor do esterno superior, em vez do pescoço, para evitar a obstrução das vias aéreas. Se a respiração parecer difícil ou obstruída, afrouxe o cordão ou mova-o posteriormente. Execute este procedimento enquanto o rato está alerta.
6. Prenda a placa de retenção da cabeça no rato à peça correspondente no gabarito. Para fazer isso, primeiro prenda a placa do encosto de cabeça no lugar e, em seguida, prenda-a usando um parafuso 4-40. Certifique-se de esperar até que o animal esteja calmo para evitar a aplicação de torque excessivo na cabeça. Em seguida, coloque uma porca 8-32 no parafuso de retenção da cabeça que está implantado no rato. Em seguida, aparafuse uma haste rosqueada de aço inoxidável no parafuso principal. Fixe a haste no gabarito experimental de forma que possa ser apertada no lugar (Figura 1).
   NOTA: Prender o animal com o parafuso de cabeça, bem como com a placa de apoio de cabeça, minimiza a flexão do aparelho e melhora a estabilidade da gravação. Na maioria dos casos, a gravação pode começar no primeiro dia em que o animal é contido na cabeça. No entanto, se o animal se mexer excessivamente ou vocalizar, forneça um dia de treinamento de habituação com contenção de cabeça antes de iniciar qualquer gravação. Nesse caso, deixe o animal no gabarito por 15 min e depois coloque-o de volta na gaiola. Repita esta etapa no dia seguinte e continue com o protocolo.
7. Abra a câmara de gravação e remova o gel de silicone. Se o tecido voltou a crescer na craniotomia, limpe-o com uma pinça fina.
8. Conecte a pipeta ao micromanipulador motorizado e conecte o headstage pré-amplificador.
   NOTA: Na presente demonstração, um pequeno circuito de relé no cabeçote stage alterna entre os fios condutores do amplificador e uma fonte de corrente externa com alta conformidade(Figura 3A-C). Observe que alguns amplificadores têm uma fonte de alta conformidade integrada apropriada.
9. Use o micromanipulador motorizado para mover a ponta da pipeta para a marca identificada estereotaxicamente na câmara de gravação. Anote as coordenadas deste local. Tenha cuidado para não quebrar a ponta da pipeta no crânio.
10. Mova a pipeta para o local de registro desejado nos eixos ântero-posterior e mediolateral. Em seguida, avance a pipeta ventralmente através da dura-máter até que esteja aproximadamente 500 μm dorsal do local de registro pretendido.
11. Avance lentamente a pipeta enquanto ouve eventos de pico em um monitor de áudio do ampvol lificadotage gravado entre a ponta da pipeta e o fio de referência. Uma vez identificados os eventos de pico, continue a mover a pipeta de 0 a 100 μm até que sejam observadas deflexões de tensão positivas superiores a aproximadamente 500 μV.
    NOTA: A resistência do eletrodo aumentará por um fator de aproximadamente 1,5-10 quando isso ocorrer.
12. O registro deve começar assim que uma unidade for isolada, juntamente com todas as outras medidas comportamentais e fisiológicas de interesse. Na presente demonstração, os movimentos da vibrissa autogerados são monitorados com videografia de alta velocidade (consulte a seção Materiais ).
13. Para rotular o local de gravação, troque os fios do eletrodo para conectar à fonte de corrente. Existem várias maneiras de fazer isso, usando um circuito de relé(Figura 3A-C), uma fonte de corrente embutida no amplificador ou manualmente(Figura 3D). Passe -4 μA com pulsos de 2 segundos a 50% do ciclo de trabalho por 4 min para injetar iontoforeticamente Chicago Sky Blue através da pipeta.
14. Mate e perfunda o animal após vários procedimentos de rotulagem de acordo com a prática padrão. Corte o cérebro e contra-core conforme necessário para identificar a localização anatômica do local de registro. Contra-core o tecido para reatividade da citocromo oxidase. Alternativamente, identifique os depósitos Chicago Sky Blue usando microscopia de fluorescência.
    NOTA: Para diferenciar com precisão as diferentes unidades rotuladas, é importante que todas as etiquetas sejam feitas com a mesma pipeta no mesmo dia, sem desapertar a pipeta entre as etiquetas. Nesse caso, os locais de registro podem ser diferenciados por suas localizações relativas na histologia post-hoc, juntamente com as coordenadas do manipulador anotadas de cada local. Para uma identificação inequívoca, marque os rótulos a pelo menos 200 μm de distância um do outro e não mais do que 3-5 rótulos por região do cérebro.

Results

Figura 1: Gabarito experimental. Diagrama de rato no gabarito mecânico para experimentos de monitoramento eletrofisiológico e comportamental. O gabarito utiliza a barra e a placa

Materials