Aproveitando os avanços na fluoróforo desenvolvimento e tecnologia de imagem, um método simples de Alexa Fluor rotulagem de vírus da dengue foi planejado para visualizar a interação precoce entre vírus e células.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Visualizando Vírus da Dengue por meio Alexa Fluor Labeling
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os eventos iniciais na interação entre vírus e células podem ter profunda influência sobre o resultado da infecção. Determinar os fatores que influenciam essa interação pode levar a uma melhor compreensão da patogênese da doença e assim influenciar a vacina ou o projeto terapêutico. Assim, o desenvolvimento de métodos para investigar essa interação seria útil. Os recentes avanços na fluoróforos desenvolvimento 1-3 e tecnologia de imagem 4 pode ser explorada para melhorar o nosso conhecimento atual sobre a patogênese da dengue e assim pavimentar o caminho para reduzir os milhões de infecções por dengue ocorrem anualmente.
O vírus da dengue envolvido tem um andaime externo composto de 90 glicoproteína do envelope (E) dímeros que protejam o reservatório nucleocapsídeo, que contém uma fita única de RNA positivo genoma 5. As subunidades idênticas de proteína na superfície do vírus pode assim ser rotulados com um corante reativo de amina e visualizados através de microscopia de imunofluorescência. Aqui, apresentamos um método simples de rotulagem do vírus da dengue com Alexa Fluor succinimidyl éster corante dissolvido diretamente em um buffer de bicarbonato de sódio que rendeu vírus altamente viável após rotulagem. Não existe um procedimento padronizado para a rotulagem de vírus vivo e protocolo do fabricante existente para a rotulagem de proteínas geralmente requer a reconstituição do corante em dimetilsulfóxido. A presença de dimetilsulfóxido, mesmo em quantidades mínimas, podem bloquear a infecção produtiva de vírus e também induzir citotoxicidade de 6 células. A exclusão do uso de dimetil sulfóxido neste protocolo, assim, reduzida essa possibilidade. Corantes Alexa Fluor têm fotoestabilidade superior e são menos sensíveis ao pH do que as tinturas comuns, como a fluoresceína e rodamina 2, tornando-as ideais para estudos sobre a absorção celular e transporte endossomal do vírus. A conjugação de Alexa Fluor tintura não afeta o reconhecimento do vírus da dengue rotulado por vírus específicos de anticorpos e seus supostos receptores em células hospedeiras 7. Esse método pode ter aplicações úteis em estudos virológicos.
Protocolo
1. Alexa Fluor rotulagem de vírus da dengue
- Antes da reação de rotulagem, purificar o vírus da dengue com almofada de sacarose e preparar os reagentes e equipamentos necessários, conforme indicado no protocolo.
- Prepare tampão de bicarbonato de sódio 0,2 M fresca, pH 8,5 (tampão de marcação), e 1,5 M tampão hidroxilamina, pH 8.3 (parar de reagente), pouco antes de rotulagem e filtro de esterilizar com filtros de seringa 0,2 Hm.
- Diluir aproximadamente 3x10 8 unidades formadoras de placa (UFP) de vírus da dengue purificada em 1ml de rotulagem de buffer em um tubo de 2 ml. Isto pode ser ampliado proporcionalmente para a rotulagem....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Embora AF594 corante foi usado neste relatório, uma ampla gama de fluoróforos na succinimidyl Alexa Fluor ésteres série está disponível com a química rotulagem similar. Isso poderia estender a aplicação rotulagem além de imagens. Citometria de fluxo pode ser usado como uma alternativa para microscopia confocal para estimar o grau de rotulagem para os fluoróforos que pode ser animado e detectado pela máquina FACS.
Corantes Alexa Fluor são pequenas moléculas que reagem com grupos amino livres,.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não temos nada para revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela National Medical Research Council, de Cingapura.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
| Bicarbonato de sódio | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hidroxilamina | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Hidróxido de sódio | Merck | 106498 | |
| AF594 ésteres succinimidyl | Sondas moleculares, Invitrogen | A20004 | |
| PD-10 coluna | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4 bem-placa | Nunc | 176740 | |
| Lamínulas | Einst | 0111520 | |
| Lâmina de microscópio | Vela Marca | 7105 | |
| 3H5 hibridoma | ATCC | HB46 | |
| PBS 10x | 1 Base de Dados | BUF-2040-10X1L | |
| Saponina | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cloreto de magnésio | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Cloreto de cálcio | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Centrífuga de mesa | Eppendorf | 5424 | |
| Microscópio confocal | Zeiss | LSM 710 |
Para preparar M-199 meio de crescimento, adicionar 50ml de FBS, 5 ml de piruvato de sódio e 5 ml de não-aminoácidos essenciais para 500ml de M-199, filtro estéril.
Para preparar M-199 meio de manutenção, adicionar 15ml de FBS, 5 ml de piruvato de sódio e 5 ml de não-aminoácidos essenciais para 500ml de M-199, filtro estéril.
Referências
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &, Davidson, M. W. The Fluorescent Protein Color Palette. Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield excep....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
