Entrega de células-tronco mesenquimais intranasais em um modelo de camundongo com lesão cerebral traumática

Resumo

Fonte: Shahror, R. A. et. al., Rastreando células-tronco mesenquimais marcadas com óxido de ferro superparamagnético usando ressonância magnética após entrega intranasal em um modelo murino de lesão cerebral traumática. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a entrega intranasal de células-tronco mesenquimais (MSC) em um modelo de camundongo. As MSCs são absorvidas pelo tecido nasal, migram para o cérebro por meio de sinais de citocinas e secretam fatores neurotróficos no local da lesão, oferecendo potencial neuroterapêutico para reparo neuronal.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Marcação de células-tronco mesenquimais (MSCs) com nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro (SPIO)

1. Para marcar MSCs com SPIO, adicione 6 mL de meio de marcação (25 μg/mL de SPIO no meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sem soro fetal bovino (FBS)) a um frasco T75 contendo MSCs (80% de confluência).
2. Incubar as células com o meio de marcação numa incubadora de CO₂ (37 °C, 5% CO₂ ) sem agitar. Após 24 h, remova cuidadosamente o meio de rotulagem usando uma pipeta Pasteur estéril com uma ponta de plástico presa a um vácuo. Lave as células em monocamada 2x com 6 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover quaisquer vestígios de SPIO não internalizado.
   1. Para determinar se as células foram marcadas com sucesso, verifique as células marcadas em um microscópio fluorescente ou microscópio confocal se o SPIO estiver marcado com um fluoróforo (ou seja, como os usados aqui; Figura 1B, C).
3. Colha as células aderentes por tratamento com 3 mL de tripsina e incube a 37 °C. Após 5 min de incubação, adicione 7 mL de meio DMEM pré-aquecido com 10% de FBS (v/v) para inativar a tripsina. Recolha a suspensão celular usando uma pipeta em um tubo cônico de 15 mL.
4. Centrifugar a suspensão celular a 300 x g durante 5 min. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em PBS. Conte as células viáveis usando corante azul de tripano e um hemocitômetro.
   NOTA: O pellet celular das células marcadas aparecerá como uma cor escura devido à carga de ferro (Figura 1D). Este protocolo é relevante para marcação de MSC e ressonância magnética (MRI). O procedimento para marcação de MSC foi otimizado anteriormente, e apenas as etapas para preparar MSCs marcadas para rastrear in vivo estão incluídas aqui, uma vez que o rastreamento in vivo é o foco. O protocolo de cultura e marcação de outros tipos de células deve ser otimizado pelo pesquisador.
5. Ajuste a concentração celular usando PBS para 150.000 células (ou um número que resulte em um sinal de ressonância magnética suficiente) em 18 μL de PBS (ou o volume total que será usado no procedimento de administração intranasal).
   NOTA: Percebeu-se que uma concentração celular superior a 150.000 células/18 μL de PBS leva à agregação celular, o que pode afetar a eficiência da administração intranasal. Se for necessário um número maior de células para a administração intranasal, aumente o volume total da suspensão celular e aumente o número de administrações intranasais, pois a administração intranasal é um procedimento não invasivo e a dosagem múltipla é possível.

2. Lesão de Impacto Cortical Controlado (CCI)

NOTA: Neste protocolo, camundongos C57 BL / 6 machos (7 a 8 semanas de idade) foram mantidos em um ciclo claro / escuro de 12/12 h com acesso ad libitum a comida e água.

1. Para preparar cada camundongo para lesão por ICC, administre o coquetel anestésico zolazepam (50 mg / kg) e xilazina (20 mg / kg) por meio de injeção intraperitoneal (ip) (1 mL / kg). Certifique-se de que a profundidade da anestesia seja suficiente por falta de resposta ao pinçamento do dedo do pé. Alternativamente, coloque o camundongo em uma câmara fornecida com 2% a 4% de isoflurano por 60 s.
2. Raspe o pelo da superfície dorsal do crânio entre as orelhas usando uma máquina de cortar cabelo eletrônica. Limpe a área raspada várias vezes usando um cotonete estéril embebido em iodo. Use um cotonete embebido em etanol 70% para limpar o iodo.
3. Coloque o mouse anestesiado na estrutura estereotáxica e prenda o mouse usando barras auriculares e frontais. Faça uma incisão sagital mediana (aproximadamente 2,5 cm) na pele raspada usando uma tesoura estéril para acessar a superfície do crânio.
4. Remova o tecido do osso usando uma almofada de algodão para expor o crânio. Limpe a superfície do crânio usando um cotonete embebido em peróxido de hidrogênio a 3% (H₂O₂) por 10 s e, em seguida, limpe-o com um algodão seco.
   NOTA: As suturas do crânio e o bregma e o lambda agora podem ser facilmente identificados.
5. Identificar as coordenadas de escolha na superfície do crânio para a lesão do CCI e desenhar um círculo (4 mm de diâmetro) ao redor das coordenadas usando um lápis ou marcador próprio.
   NOTA: Neste protocolo, as coordenadas ântero-posterior (AP) -2,0 mm e mediolateral (ML) +1,5 mm foram utilizadas para a indução do CCI.
6. Use uma microbroca e uma rebarba redonda (0,5 mm de diâmetro) para afinar o crânio no círculo marcado. Evite aplicar pressão durante a perfuração, pois perfurar o osso pode causar danos ao parênquima cerebral. Limpe o pó ósseo usando um cotonete limpo e seco.
7. Remova suavemente o retalho ósseo usando uma pinça fina estéril para expor a dura-máter, mantendo-a intacta. Remova o mouse do quadro estereotáxico que foi usado para a preparação pré-lesão e coloque-o no quadro estereotáxico do dispositivo CCI.
8. Estabilize a cabeça do mouse usando as barras auriculares e as barras nasais. Certifique-se de que a cabeça do mouse esteja nivelada na direção rostral-caudal e ajuste as barras nasais, se necessário.
9. Siga as instruções na caixa de controle para zerar a ponta do pêndulo na superfície cortical exposta. Certifique-se de que a ponta do pêndulo esteja alinhada diretamente acima das coordenadas do córtex desejadas a serem impactadas usando as rodas de controle X e Y na base do pêndulo.
10. Defina os parâmetros do experimento usando a caixa de controle com uma velocidade de 5 m/s, tempo de permanência de 250 ms e profundidade de lesão de 1 mm para induzir lesão leve no camundongo.
11. Induza ferimentos pressionando o botão ''impacto'' na caixa de controle. Limpe qualquer sangramento que ocorra usando um cotonete estéril.
12. Remova o mouse da estrutura estereotáxica e feche a incisão usando suturas cirúrgicas de seda. Não use clipes de metal para fechar o local da cirurgia, pois o mouse será submetido a um campo magnético para ressonância magnética.
13. Aplique antibióticos tópicos (bacitracina, neomicina) no local da cirurgia para prevenir infecções. Mantenha o mouse na almofada de aquecimento e monitore-o de perto durante a fase de recuperação.
14. Administre cetoprofeno (2,5 mg/kg, IP) diariamente por 3 dias após a cirurgia, a menos que a administração de cetoprofeno contradiga os objetivos do estudo.

3. Entrega intranasal

1. 1 dia após a indução da ICC, administre o coquetel anestésico zolazepam (50 mg/kg) e xilazina (20 mg/kg) via injeção intravenosa. Certifique-se de que o mouse esteja profundamente anestesiado pela falta de resposta ao beliscão do dedo do pé.
2. Prepare o camundongo para a administração intranasal de MSCs por tratamento com hialuronidase.
   1. Pegue a nuca do rato e vire de costas com firmeza enquanto imobiliza o crânio. Coloque a ponta de uma pipeta que contenha hialuronidase em PBS estéril (4 U/μL) perto da narina do camundongo em um ângulo de 45°.
   2. Administre 3 μL de suspensão de hialuronidase em cada narina. Mantenha o mouse imobilizado e voltado para cima em uma almofada limpa por 5 min. Repita o tratamento com hialuronidase 4x (total de 100 U de suspensão de hialuronidase).
3. Após o tratamento com hialuronidase, mantenha o camundongo tratado em uma almofada limpa voltada para cima por 30 min.
4. Para entregar MSCs no cérebro, segure o mouse com firmeza, conforme descrito na etapa 3.2.1. Administre 3 μL / narina de suspensão MSC com um intervalo de 3 s. Mantenha o mouse na mesma posição por 30 s até que as gotas de amostra desapareçam completamente.
   NOTA: Evite formar bolhas de ar durante a administração.
5. Repita a administração com um intervalo de 2 minutos até 3x.
   NOTA: O número total de células a serem entregues é de 150.000, de modo que 18 μL da suspensão celular podem ser administrados na dosagem de 3 μL para cada narina, 3x cada.
6. Retorne o mouse à gaiola e monitore-o de perto até que ele se recupere totalmente da anestesia.

Resultados

Figura 1: Fluxograma esquemático do protocolo e confirmação in vitro da aceitação de SPIO pelas MSCs. (A) As MSCs foram incubadas com SPIO por 24 horas para rotulagem. Em seguida, as MSCs marcadas foram entregues em um modelo de camundongo TBI por meio de...

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