Estimulação elétrica transcraniana do córtex motor em um rato acordado

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Procedimento cirúrgico: Implante de eletrodo torácico

NOTA: Esta etapa pode ser ignorada quando o contra-eletrodo é colocado externamente no tórax raspado com um colete.

1. Coloque o roedor em decúbito ventral (no peito) na mesa de operação.
   NOTA: Em caso de anestesia inalatória, mantenha o focinho do rato colocado no bico de anestesia, reduzindo ainda mais a concentração de isoflurano para 1,5-2%.
2. Desinfete o couro cabeludo raspado com um spray desinfetante ou com um cotonete embebido em um agente anti-séptico (por exemplo, etanol 70%) e deixe secar ao ar. Repita duas vezes.
3. Corte a pele com um bisturi em uma linha do nível do olho rostral até o nível do ouvido médio.
   NOTA: Isso permite o tunelamento do cabo de conexão do eletrodo torácico implantado em direção ao topo da cabeça e também é o corte desejado para a colocação do soquete do eletrodo de estimulação por corrente contínua (DCS).
4. Vire o rato para a posição supina, de modo que o tórax fique exposto.
5. Desinfete a pele do tórax conforme descrito na etapa 1.2.
6. Eleve a pele lateral do tórax direito com uma pinça de tecido e corte uma casa de botão com uma pequena tesoura de cerca de 0,5 cm medial da axila direita. Em seguida, faça um corte sagital reto na orientação cranial com a tesoura.
7. Forme uma bolsa subcutânea desconectando atraumaticamente a pele do músculo peitoral maior esquerdo. Faça isso abrindo repetidamente a tesoura pequena (ou com um cotonete embebido em solução salina).
8. Vire o animal do lado direito para tunelar o caminho do cabo do canto occipital esquerdo da pele da cabeça aberta ao longo do pescoço para sair na bolsa peitoral, penetrando na fáscia superficial usando uma pinça homeostática.
9. Abra cuidadosamente a pinça homeostática para agarrar a extremidade do cabo do eletrodo conectado ao eletrodo de platina sem permitir que fios afiados se percam. Puxe o cabo pelo túnel até que o eletrodo entre na bolsa, orientado com a ponta de solda voltada para o membro posterior esquerdo do roedor. Vire o roedor de volta para a posição de bruços.
10. Fixe a placa de platina com uma sutura sintética estéril trançada e não absorvível na fáscia peitoral nos dois orifícios de canto opostos (4-5 nós são recomendados para estabilidade).
11. Da mesma forma, prenda o cabo à fáscia por um nó solto, formando um leve laço antes da entrada do túnel de tecido.
12. Feche a pele com 3-4 suturas cutâneas, dependendo do tamanho do corte (o mesmo material de sutura pode ser usado para o eletrodo e o cabo).

2. Procedimento Cirúrgico: Colocação do Soquete de Estimulação Elétrica Cerebral Transcraniana Epicraniana (tES)

1. Coloque o animal em uma estrutura estereotáxica.
   NOTA: Se estiver usando anestesia inalatória, abaixe a concentração do anestésico para um fluxo de isoflurano de manutenção de ~ 1,5-1%, ajustado ao reflexo de pinça do dedo do pé e ao padrão respiratório.
2. Desinfete o couro cabeludo raspado conforme descrito na etapa 1.2.
3. Corte a pele com um bisturi em uma linha do nível do olho rostral até o nível da orelha média.
   NOTA: Se a colocação do eletrodo torácico foi realizada, as etapas 2.2 e 2.3 já foram executadas.
4. Raspe o periósteo (tecido conjuntivo do crânio) para os lados com o bisturi e limpe bem com cotonetes. Fixe o tecido conjuntivo nos 4 cantos do corte com grampos de buldogue e deixe-os pendurados lateralmente para manter o campo de cirurgia aberto.
5. Aplique solução salina a 0,9% para limpar a superfície óssea e o tecido com cotonetes. Em seguida, limpe a superfície óssea com 3% de H₂O₂. Evite o contato com o tecido. Por meio deste, o osso é limpo mais completamente e um pequeno sangramento do osso será interrompido. Além disso, os resíduos do periósteo tornam-se visíveis. Remova esses resíduos com um cotonete aplicando pressão moderada.
   NOTA: A remoção dos resíduos do periósteo aumentará a adesão e a durabilidade do encaixe tES colado no osso.
   1. Em caso de sangramento imparável, use uma broca óssea e toque-a por 1-3 s com leve pressão no osso. Este procedimento mecânico, na maioria dos casos, interromperá o sangramento sem aquecimento significativo. Nunca use eletrocautério no osso; Mesmo uma breve aplicação resultará em danos ao tecido cerebral (o eletrocautério deve ser usado apenas para sangramento do tecido da ferida).
6. Como os parafusos de fixação melhorarão a aderência da configuração, escolha uma broca adequada ao tamanho do parafuso. Coloque dois furos de rebarba em duas placas ósseas diferentes pré-perfurando com uma broca manual e, em seguida, aplicando uma leve pressão vertical com a broca óssea. Evite a proximidade com a posição desejada do soquete tES, pois isso pode dificultar o aparafusamento do eletrodo (por exemplo, para tES corticais motores primários esquerdos, escolha a posição do parafuso frontal direito e parietal posterior).
7. No caso de um contra-eletrodo implantado, faça um terceiro orifício localizado no osso parietal posterior direito para futura fixação do cabo tunelizado.
8. Coloque os parafusos de plástico nos orifícios das rebarbas e aperte até sentir o primeiro atrito. Em seguida, execute três voltas adicionais de parafuso de 180 °. Verifique com uma pinça a estabilidade do parafuso e adicione mais uma volta se não estiver apertado o suficiente.
   NOTA: Para ratos adultos, isso garantirá a colocação peridural dos parafusos sem danificar a dura-máter ou o cérebro (dependendo do design da rosca do parafuso, o número da volta pode variar). O uso de parafusos de aço inoxidável também deve ser viável, pois mesmo em DCS densidades de corrente acima do limiar de neurodegeneração; A colocação do parafuso não perturbou a localização ou extensão da lesão abaixo dos parafusos.
9. Ligue o ferro de solda e pré-aqueça por aproximadamente 5 min. Enrole o cabo que sai do túnel de tecido occipitalmente ao redor do parafuso parietal direito e corte-o, deixando aproximadamente 1 cm de cabo atrás do enrolamento. Retire cuidadosamente o isolamento na extremidade do cabo com um bisturi.
10. Fixe o cabo enrolado ao parafuso e ao osso com cola cianoacrílica.
11. Aplique uma pequena quantidade de solda de estanho sem chumbo no conector e nos fios desencapados do cabo do contra-eletrodo e conecte ambos pressionando brevemente as duas partes pré-soldadas juntas enquanto toca na ponta de solda até que a solda de estanho derreta (cerca de 2-3 s). Remova a ponta de solda imediatamente para evitar o aquecimento excessivo do metal do cabo com danos subsequentes ao tecido.
12. Pegue o soquete do eletrodo tES feito sob medida (Figura 1B, em vermelho) com uma pinça de ponta serrilhada dobrada e aplique uma fina camada de cola cianoacrílica na borda inferior do soquete. Para colocação acima do córtex motor e usando um soquete de 4 mm de diâmetro, coloque o ponto do soquete médio a 2 mm anterior e 2 mm lateral do bregma. Para esta posição, a borda medial interna do alvéolo deve terminar diretamente na sutura sagital e a borda caudal deve terminar na altura do bregma. Pressione o soquete brevemente no osso (a maioria das colas cianoacrílicas endurece por pressão).
    NOTA: Colocar uma fonte de luz diretamente acima do soquete pode facilitar a colocação do soquete.
13. Certifique-se de que o osso dentro da área do soquete esteja livre de cola (verificando com luz porque a cola é reflexiva). No caso de derramamento de cola, remova o soquete, raspe a cola com o bisturi e repita a etapa 2.12.
14. Depois que o alvéolo estiver no lugar e a futura área de estimulação estiver livre de cola, primeiro sele a borda lateral do alvéolo ao tecido vizinho com uma pequena gota de cola cianoacrílica para evitar uma ponte de fluido que possa levar ao desvio de corrente neste local. Não aplique muita cola, pois ela pode fluir para a área de estimulação (se isso ocorrer, retorne à etapa 2.12).
    NOTA: Manter a área de estimulação livre de cola é crucial, pois uma redução da área de estimulação pode aumentar drasticamente a densidade de corrente (A/m²).
15. Cubra todos os parafusos com cola cianoacrílica.
16. Misture o cimento acrílico dental de dois componentes em um pequeno tubo de silicone ou vidro. Assim que se tornar viscoso, aplique-o com uma espátula dentária para selar as bordas restantes do alvéolo ao osso. Evite qualquer fluxo de cimento acrílico dental para a área de estimulação.
17. Por fim, cubra todo o crânio, parafusos, cabo do contra-eletrodo e o soquete até 1/3 do soquete com cimento acrílico dentário. Certifique-se de que o cimento tenha a viscosidade correta: se for muito fluido, fluirá para o tecido circundante; se for muito difícil, é difícil distribuí-lo uniformemente.
18. Quando todo o osso estiver coberto e o cimento endurecido, remova as pinças do buldogue; a pele deve apenas tocar o cimento acumulado para que a sutura não seja necessária. (Se o corte inicial foi escolhido muito longo e o tecido ou músculo conjuntivo estiver visível, aplique uma sutura conforme descrito na etapa 1.12).
19. Aplique uma camada de iodo com um cotonete ao redor da borda da pele cortada e injete carprofeno por via subcutânea (5 mg/kg de peso corporal dissolvido em 5-7,5 mL de soro fisiológico a 0,9% para tratamento da dor e reposição de fluidos).
    NOTA: Se estiver usando anestesia inalatória, desligue-a agora.
20. Coloque o roedor em uma caixa de aquecimento para recuperação da anestesia até que o roedor esteja acordado e a estabilidade postural seja restaurada.
    NOTA: Verifique diariamente o desenvolvimento do peso, o estado da ferida e os critérios gerais de bem-estar do animal, de acordo com a recomendação da instituição.

3. Procedimento de Estimulação Elétrica Transcraniana

NOTA: Como a anestesia afeta os efeitos do tES, recomenda-se realizar a estimulação em roedores alertas sempre que possível. Deixe o roedor se recuperar por pelo menos 5 dias (cicatrização da ferida na cabeça e no peito) antes de iniciar os experimentos. Os experimentos podem ser realizados em momentos anteriores após a cirurgia ao usar um contra-eletrodo externo fixado com um colete, pois a ferida no peito é mais irritável, mas os animais precisam estar habituados ao colete de eletrodo por vários dias e pode ocorrer interferência nas tarefas comportamentais.

1. Encha a metade do soquete do eletrodo tES com solução salina a 0,9% e remova as bolhas de ar.
2. Antes das sessões de estimulação transcraniana por corrente contínua catódica (ETCC), sempre verifique a cloração e, se necessário (como uma superfície prateada brilhante), clore novamente o eletrodo Ag / AgCl. Antes das sessões de ETCC anódica, remova possíveis depósitos excessivos de AgCl de estímulos anteriores com uma lixa para permitir uma boa condutividade durante a estimulação. Aparafuse a tampa de rosca do eletrodo tES (Figura 1B, peça cinza).
   CUIDADO: A falha em reclorar o eletrodo entre as sessões de ETCC catódica levará ao esgotamento da cloração durante a estimulação e ao acúmulo tóxico por reação eletroquímica. Isso induzirá danos aos tecidos. A recloração não é necessária em uma única sessão se a duração da estimulação for inferior a 20 min.
3. Conecte os cabos aos dois conectores na cabeça (para estimulação anódica, o cabo anódico é conectado ao conector na tampa de rosca, para estimulação catódica, é o oposto).
   NOTA: Ao usar um contra-eletrodo colocado externamente, cubra o contra-eletrodo com gel condutor e coloque-o no peito do roedor. Isso é mais fácil se o eletrodo for pré-fixado em um pequeno colete de roedores, que o roedor pode usar durante a estimulação.
4. Coloque o roedor na gaiola experimental, com os cabos conectados a um giro acima da gaiola que permite o movimento livre.
5. Ligue o estimulador e ajuste os parâmetros de estimulação (intensidade da estimulação, duração, tempo de aumento e inatividade).
6. Quando não estiver usando um dispositivo de estimulação disponível comercialmente com alarme de desligamento e desconexão de segurança, inclua um medidor no circuito para verificar o fluxo de corrente constante.
   NOTA: Com esta configuração, a estimulação pode ser aplicada durante a execução ou treinamento de tarefas comportamentais.
7. Verifique se há sinais de estresse ou desconforto no roedor durante a estimulação.
8. Após o término da estimulação, desconecte os cabos, desparafuse a tampa do eletrodo na cabeça e limpe e seque o soquete com um cotonete. Devolva o roedor ao ambiente doméstico ou prossiga com um procedimento comportamental, se desejar.

Figura 1: Suprimentos para cirurgia e esquema técnico do soquete tES e da unidade de tampa do eletrodo. (A) 1. Cotonetes, 2. desinfetante, 3. quadro estereotáxico, 4. ferro de solda, 5. analgésico (por exemplo, carprofeno), 6. & 7. anestésicos (por exemplo, xilazina e cetamina), 8. seringa, 9. clipper, 10. perfurador de orelha, 11. pomada para os olhos (por exemplo, bepanteno), 12. solda de estanho sem chumbo, 13. cimento acrílico dentário de dois componentes (DAC), 14. iodo, 15. 3% H2O2, 16. solução salina a 0,9%, 17. sutura sintética trançada não absorvível (por exemplo, Mersilene 4-0), 18. brocas, 19. cola cianoacrílica, 20. grampos bulldog 21. fórceps homeostático, 22. pinça de ponta serrilhada dobrada, 23. pinça de ponta reta e afiada, 24. em linha reta, fórceps de tecido, 25. espátula dentária, 26. bisturi, 27. tesoura, 28. broca manual, 29. chave de fenda, 30. broca motorizada, 31. conectores fêmea, 32. soquete tES, 33. eletrodo quadrado de platina preso ao cabo, junta de solda coberta com cola histoacrílica, 34. parafusos de plástico. (B) soquete tES (vermelho) para fixação no crânio do roedor com diâmetro interno de 4 mm; a unidade de eletrodo (cinza) é construída por uma tampa de rosca e um carimbo interno com um orifício central deixando espaço para o cabo do eletrodo de disco Ag/Cl, que é colado na parte inferior do carimbo. Isso permite a máxima estabilidade da configuração e evita quebras de fio no ponto sensível de conexão fio-eletrodo.