Expansão do sangue periférico humano γδ células T usando zoledronato

Resumo

Um método para expandir células T γδ a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) é descrito. PBMC células derivadas de T γδ são estimuladas e expandida usando zoledronato e interleucina-2 (IL-2). Expansão em grande escala de células T γδ podem ser aplicadas a imunoterapia celular autóloga de câncer.

Resumo

Células T γδ podem reconhecer e responder a uma grande variedade de estresse induzido por antígenos, desenvolvendo assim uma atividade ampla inata anti-tumorais e anti-infecciosos. ¹ A maioria das células T γδ no sangue periférico tem o Vγ9Vδ2 receptor de células T. Estas células reconhecem o antígeno em um principal de histocompatibilidade forma complexa independente e desenvolver forte citolítica e Th1-like funções efetoras. ¹ Portanto, as células T γδ são células efetoras candidato atraente para a imunoterapia do câncer. Vγ9Vδ2 células T responder a phosphoantigens tais como (E)-4-hidroxi-3-metil-but-2-enilo pirofosfato (HMBPP), que é sintetizada em bactérias através de biossíntese de isoprenóides; ² e isopentenil pirofosfato (IPP), que é produzido em células eucarióticas através da via mevalonato. ³ Na condição fisiológica, a geração de IPP na célula nontransformed não é suficiente para a ativação de células T γδ. Desregulação da via mevalonato em células tumorais leva ao acúmulo de IPP e γδ T ativação das células. ³ Porque aminobisphosphonates (tais como o pamidronato ou zoledronato) inibem sintase farnesil pirofosfato (FPP), a enzima agir a jusante do IPP na via mevalonato, níveis intracelulares de IPP e sensitibity para γδ reconhecimento células T pode ser terapeuticamente aumentou aminobisphosphonates. IPP acumulação é menos eficiente nas células nontransfomred de células tumorais com uma concentração farmacologicamente relevantes da aminobisphosphonates, que nos permitem imunoterapia para o câncer, ativando as células T γδ com aminobisphosphonates. ⁴ Curiosamente, IPP acumula em monócitos quando PBMC são tratados com aminobisphosphonates, por causa do eficiente absorção de drogas por essas células. ⁵ monócitos que se acumulam IPP se tornar células apresentadoras de antígenos e estimular Vγ9Vδ2 células T no sangue periférico. ⁶ Com base nesses mecanismos, nós desenvolvemos uma técnica de expansão em grande escala de culturas de células T γδ usando zoledronato e interleucina -2 (IL-2). ⁷ Outros métodos para a expansão de células T γδ utilizar o pirofosfato bromohydrin sintéticos phosphoantigens (BrHPP) ⁸ ou 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP). ⁹ Todos estes métodos permitem que ex vivo de expansão, resultando em um grande número de células T γδ para uso em imunoterapia adotiva. No entanto, apenas zoledronato é um reagente FDA-approved disponíveis comercialmente. Zoledronato-expandida de células T γδ mostrar CD27 ^- CD45RA ^- fenótipo de memória efetoras e sua função pode ser avaliada por IFN-γ ensaio de produção ^7.

Protocolo

1. Isolamento de PBMC

1. Coleta de sangue (7,5-8,0 ml) em um BD Vacutainer CPT Tubo preparação celular com heparina sódica. O tubo contém um anticoagulante heparina sódica e um fluido de densidade Ficoll-Hypaque, além de uma barreira de gel de poliéster, que separa os dois líquidos. Tubo de centrifugação / amostra de sangue em temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) em um rotor horizontal (swing out-cabeça) por 20 min a 1800 x g. Interruptor centrífuga freios off.
2. Após a centrifugação, a seqüência de camadas ocorre da seguinte forma (visto de cima para baixo): um plasma) - b) células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e plaquetas - c) solução de densidade - d) gel de poliéster - e) granulócitos - f) glóbulos vermelhos (Fig. 1).
3. Coletar uma fração da camada de plasma, deixando 5 a 10 mm de plasma acima da interfase sem perturbar a camada de células. O plasma pode ser usado para a cultura (seção 2.5).
4. Colheita da fração enriquecida (PBMC) na interfase com uma pipeta e transferir para um tubo de 15 ml.
5. Lave o PBMC com 10 ml de tampão fosfato (PBS), invertendo o tubo 5 vezes, e então centrifugar por 5 min a 400 x g.
6. Repita os passos de lavagem duas vezes, e, em seguida, ressuspender o sedimento celular em 5 ml de PBS. Determinar o número de células. Normalmente, 1,3 x10 ⁶ células são recuperados a partir de 1 ml de sangue total.
7. Determinar a freqüência e fenótipo de células T γδ em PBMC por citometria de fluxo (seção 3) (Fig. 2).

2. Expansão de células T γδ

1. Centrífuga suspensões de células em 15 ml tubos cônicos por 5 min a 400 x g à temperatura ambiente, e descartar o sobrenadante.
2. Prepare meio de cultura (CM), acrescentando IL-2 humana (IL-2) e zoledronato (Zometa) para concentrações finais de 1000 UI / ml e 5 mM, respectivamente. ALyS203 (Cell Science & Technology Institute) ou Optmizer (Invitrogen) o suporte a expansão de células γδ boa T (mais informações em referências 6 e 9). Zometa é fornecido na forma líquida (4 frasco mg/5-ml). Para preparar uma solução de M 5, adicione 50 ul de Zometa para 30 ml de meio de cultura.
3. Ressuspender pellet celular em meio de cultura e ajustar a 1x10 ⁶ células / ml.
4. Ml pipeta 1 de CM contendo 1x10 ⁶ células em cada poço de uma placa de 24 poços. De grande escala culturas, as células podem ser semeados em 0,5 x 10 ⁶ células / cm ² de acordo com as áreas de superfície dos poços da placa, prato, ou balão.
5. Adicionar plasma autólogo (seção 1.3), agrupados humano AB soros, ou FCS para que seja aproximadamente 10% do volume da cultura (100 l para cada poço de uma placa de 24 poços). Coloque as placas em um umidificado 37 ° C, 5% incubadora de CO ₂ por 24-48 horas.
6. Manter a cultura, a uma densidade de células de 0,5-2 x 10 ⁶ células / ml. Adicionar meio fresco contendo IL-2 humana (1000 UI / ml) apenas (sem Zometa) a cada 2-3 dias, ea transferência de células cultivadas em novos poços ou frascos, se necessário, de acordo com o grau de proliferação celular (Fig. 3). Fornecimento de plasma ou soro ao meio de modo que a concentração sérica pode ser mantida pelo menos 1%.
7. Células colheita no dia 14/12 e determinar a freqüência de fenótipo, e as funções de células T γδ por citometria de fluxo (veja abaixo).

3. Análise fenotípica por citometria de fluxo

1. Transferência de 200 amostras l contendo 2 x 10 ⁵ células para fluorescência-activated cell sorting (FACS) tubos.
2. Adicionar 2 ml de frio PBS e centrifugar por 5 min a 400 x g. Então, voltar a suspender as pelotas em 50 mL tampão FACS (PBS + 1% FCS azida de sódio + 0,1%). Adicionar 5 mL de cada anticorpos para as amostras (os anticorpos monoclonais estão listados na Tabela 1).
3. Incubar no gelo no escuro por 20 min.
4. Adicionar 2 ml de tampão FACS para cada amostra, e depois de vórtice. Amostras de centrífuga por 5 min a 400 x g a 4 ° C. Decantar cuidadosamente o sobrenadante.
5. Ressuspender as células em 300 mL de buffer FACS e vortex. Analisar amostras em um citômetro de fluxo (Fig. 2).

4. IFN-γ ensaio de produção de ¹⁰

1. Um dia antes do ensaio, preparar células estimulador através da cultura 05/03 x10 ⁵ células Daudi / ml em meio RPMI 1640, mais 10% SFB (RPMI-10) durante a noite com Zometa (5 mM) (doravante designado Z-Daudi).
2. Coletar Z-Daudi e ressuspender em RPMI-10 em 2x10 ⁶ células / ml. Adicionar 100 ul de Z-Daudi (2x10 ⁵⁾ a cada poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços.
3. Prepare γδ células T em 2x10 ⁶ células / ml em RPMI-10 contendo Brefeldin A a 20 mg / ml. Transferência de 100 l da suspensão de células T γδ (2x10 ⁵⁾ a cada poço contendo Z-Daudi células ou para controlar poços (100 ul de RPMI-10 apenas, ou RPMI-10 com 20 ng / ml de forbol 12-miristato 13-acetato[PMA] mais 2 mg / ml de ionomicina).
4. Mix pipetando cima e para baixo várias vezes. Incubar durante 4 horas a 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora.
5. Centrifugar a placa por 5 min a 400 x g a 4 ° C e ressuspender o pellets em 200 mL de frio PBS.
6. Transferir as amostras para tubos FACS. Adicionar 4 ml de frio PBS e centrifugar os tubos por 5 min a 400 x g a 4 ° C.
7. Volte a suspender as pelotas em 50 ul de tampão FACS com FITC-conjugado anti-TCRVγ9 (5 mL) e PE/Cy5-conjugated anti-CD3 mAb (2,5 mL). Incube ao abrigo da luz por 15 min em temperatura ambiente.
8. Adicionar 100 ul de IntraPrep reagente 1 e incubar por 15 min em temperatura ambiente. Adicionar 4 ml de PBS a cada tubo e centrifugar por 5 min a 400 x g à temperatura ambiente.
9. Retire o sobrenadante por aspiração e adicione 100 ml de IntraPrep dois reagentes. Incubar por 5 min à temperatura ambiente sem agitação.
10. Adicionar 5 mL da PE-conjugado anti-IFN-γ mAb ao tubo de ensaio. Incube ao abrigo da luz por 15 min em temperatura ambiente.
11. Adicionar 4 ml de PBS a cada tubo e centrifugar por 5 min a 400 x g à temperatura ambiente. Retire o sobrenadante por aspiração e ressuspender o pellet celular em 0,5 ml de tampão FACS.
12. Analisar as células por citometria de fluxo. Portão de CD3 ^{+ +} TCRVγ9 células e examinar a expressão de IFN-γ (Fig. 4).

5. Resultados representativos:

É importante para determinar a porcentagem de células T γδ em PBMC no início da cultura. Como mostrado na figura. 2 A, a porcentagem de células CD3 ^{+ +} TCRVγ9 células T γδ em PBMC foi de 1,6% no dia 0. As populações dominantes eram CD27 ⁺ CD45RA ⁺ CD27 ⁺ ingênuo ou CD45RA ^- fenótipos de memória central. Quando as células T γδ foram eficientemente estimulados, eles formaram clusters no dia 05/03 (Fig. 3 A e B). Quando a formação do cluster foi adiada, o crescimento de outros tipos de células, tais como CD4 ⁺ ou CD8 ⁺ células T αβ ou células NK poderia dominar o crescimento de células T γδ (Fig. 3 C e D). Após 14 dias de cultura, a freqüência de células T γδ aumentou para mais de 93,8% das células cultivadas em culturas de células γδ sucesso T (Fig. 2 E). A cultura de células T γδ NKG2D upregulated CD69 e expressão (Fig. 2 G e H). Eles exibido CD27 ^- CD45RA ^- fenótipo de memória efetoras (Fig. 2 F). As funções das células T γδ foram avaliados em relação à produção de citocinas e citotoxicidade. IFN-γ o intracelular coloração demonstraram que as células T γδ IFN-γ produzido em resposta a PMA / ionomicina tratamento ou Z-Daudi células que IPP acumulado após o tratamento zoledronato (Fig. 4). Estes resultados indicam que zoledronato pode eficientemente estimular e expandir funcional das células T γδ.

tubo	FITC	PE	ECD	PE/Cy5
1	CD3	CD19	CD45	CD14
2	CD3	TCRαβ	CD4	CD8
3	CD3			CD56
4	TCR Vγ9	TCRαβ	CD45	CD3
5	TCR Vγ9	NKG2D
6	TCR Vγ9	CD69
7	TCR Vγ9	camundongo IgG1
8	TCR Vγ9		CD45RA	CD27
9	TCR Vγ9		camundongo IgG1	camundongo IgG1

Tabela 1. Anticorpos monoclonais utilizados no multicolor de coloração de células T γδ. Um exemplo da análise fenotípica de células T γδ realizados em nosso laboratório é mostrada na figura. 2.

Figura 1. Separação de PBMC. Sangue (7,5-8,0 ml) é desenhada em um BD Vacutainer CPT Tubo preparação celular com heparina sódica e directamente centrifugada por 20 min a 1800 x g. Após a centrifugação, as camadas, resultando como visto de cima para bottom: a Plasma) - b) PBMC e plaquetas - solução Densidade c) - d) gel de poliéster - e) Granulócitos - f) Os glóbulos vermelhos.

Figura 2. Fenótipo de superfície típica de células T γδ. PBMC foram estimuladas com zoledronato e IL-2 por 14 dias. Células foram marcadas com FITC-rotuladas anti-TCR Vγ9 e PE/Cy5-labeled anti-CD3 para monitorar a expansão de células T γδ (A e E). As células T γδ foram identificados por sua expressão de TCRVγ9, e sua expressão de CD27 e CD45RA (B e F), NKG2D (C e G), ou CD69 (D e H) foi examinada.

Figura 3. Representante culturas de células T γδ. PBMC foram estimuladas com IL-2 (1.000 UI / ml) e zoledronato (5 mM). Campos representativos são mostrados (IX71 microscópio invertido [Olympus] x 200). Aglomerados e agregados de células T γδ podem ser observados no dia 3 (A) e dia 5 (B), quando as células T γδ expansão com sucesso. Em contraste, não aglomerados ou agregados foram observados quando o crescimento das células T γδ não era adequado (C e D).

Figura 4. IFN γ-produção. As células T γδ foram incubadas com RPMI-10 apenas (A) ou PMA / ionomicina (B) ou Z-Daudi (C) por 4 horas. Em primeiro lugar, a expressão de superfície de TCRVγ9 estava manchada e IFN-γ, em seguida, a produção foi examinado por intracelular IFN-γ coloração.

Figura 5. Cinética da cultura de células T γδ. (A) o número absoluto de células em cultura, (B) porcentagem de células T γδ, e (C) número absoluto de células T γδ nos pontos de tempo indicado.

Discussão

O método aqui apresentado permite a expansão eficiente de células T γδ do PBMC. células γδ T ativadas e se expandiu por zoledronato e IL-2 completa desenvolver funções efetoras, refletido pela produção de citocinas e citotoxicidade. Tem sido relatado que o pirofosfato bromohydrin sintéticos phosphoantigens (BrHPP) e 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP) também expandir as células T γδ, no entanto, eles não estão disponíveis comercialmente. Em contraste, zoledronato já está licenciado para aplicações clínicas como Zo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
ZOMETA	Novartis Pharma K. K		zoledronato
Proleukin	Novartis Pharmaceuticals		IL-2 recombinante humana
BD Vacutainer CPT Tubo preparação celular com heparina sódica	BD	362753
RPMI1640	Invitrogen	21870-076
ALyS203 médio	Cell Science & Technology Institute	0301-7
Optmizer	Invitrogen	0080022SA
A brefeldin	Sigma	B5936-200UL
forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)	Sigma	P1585-1MG
ionomicina	Sigma	13909-1ml
IntraPrep	BECKMAN COULTER	A07803
anti-CD3 humano-FITC ou PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07746 FITC A07749 PE/Cy5
anti-humano CD4-ECD	BECKMAN COULTER	6604727
anti-humano CD8-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	6607011
anti-humano CD14-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07765
anti-CD19 humano-PE	BECKMAN COULTER	A07769
anti-CD45 humano-ECD	BECKMAN COULTER	A07784
anti-humano CD56-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07789
anti-humano TCRαβ-PE	BECKMAN COULTER	A39499
anti-humano TCR Vγ9-FITC	BECKMAN COULTER	IM1463
anti-humano CD27-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	6607107
anti-humano CD45RA-ECD	BECKMAN COULTER	IM2711
anti-CD69 humano-PE	BD	555531
anti-humano NKG2D-PE	BECKMAN COULTER	A08934
Anti-humal IFNγ-PE	BECKMAN COULTER	IM2717U
Isotipo IgG1-PE controle	BECKMAN COULTER	A07796
Isotipo IgG1 controle-ECD ou PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07797 A07798