Sistema de microinjeção baseado em microfluídica para infusão combinada de drogas e eletrofisiologia

Resumo

Fonte: Vanegas, M. I., et al. Sistema de microinjeção para infusão combinada de drogas e eletrofisiologia. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra um dispositivo microfluídico baseado em microeletrodo que fornece solução de medicamento através de um tubo capilar, usando uma solução de marcador à base de óleo para rastreamento preciso de volume e permitindo registro neural simultâneo e infusão de medicamento.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Construção do Microinjetor para Estimulação e Gravação (Figura 1a)

1. Meça o comprimento da cânula e da sonda (neste exemplo, um nanossensor). A sonda deve ser mais longa que a cânula pelo comprimento que deve se projetar da ponta da cânula (dependendo do design da sonda), mais aproximadamente 2 cm.
2. Sob uma lupa ou um microscópio (ampliação de ~10x), carregue a sonda na cânula; se possível, é preferível uma carga reversa para proteger a ponta da sonda.
   NOTA: Esta etapa, realizada manualmente, é desafiadora. Recomenda-se praticar com um microeletrodo sob uma lupa antes de tentar com uma sonda experimental real.
3. Passe a cânula (contendo a sonda) pela ponteira superior, junção em T e ponteira inferior.
   1. Se a sonda for apenas um único fio sem nenhum acessório, carregue-a na cânula e insira o conjunto na junção em T a partir da ponteira inferior. A parte superior da cânula (lado plano) deve ser posicionada no meio da junção em T, dentro da parte inferior, mas não na ponteira superior. A sonda experimental ou biossensor deve sobressair acima do topo da ponteira.
      NOTA: As ponteiras feitas sob medida também podem ser feitas fazendo um furo nos plugues da ponteira usando microbrocas, sendo o tamanho do furo baseado no diâmetro necessário para apertar a cânula na junção em T.
4. Use a chave de ponteira para apertar as ponteiras na parte superior e inferior da junção em T. Não aperte demais. Um pequeno pedaço de tubo pode ser adicionado para fortalecer o suporte do eletrodo dentro da ponteira superior.
5. Solde pinos de ouro em cada um dos terminais da sonda (sinal, terra, etc.), de acordo com as especificações da sonda.
6. Ajuste a posição relativa da sonda e da cânula. Meça a distância que a sonda está projetando da cânula sob ampliação e ajuste manualmente a partir da extremidade superior (a sonda pode deslizar livremente dentro das ponteiras).
7. Adicione cola epóxi entre os pinos dourados e a ponteira superior para prender a sonda à ponteira.
8. Desaparafuse a ponteira superior para retrair a sonda dentro da cânula. Confirme visualmente se a sonda está totalmente dentro da cânula sob ampliação.
9. Conecte o injetor ao microdrive.

2. Construção do Microinjetor para Infusão de Medicamentos (Figura 1b)

1. Fixe a extremidade "não chanfrada" ou plana da cânula na parte inferior da junção em T usando uma ponteira. Use a chave de ponteira para apertar a ponteira.
2. Conecte um pequeno pedaço de tubo capilar (~ 1,5 cm) ao topo da junção em T, passando-o pela ponteira padrão. Aperte com uma chave de ponteira.
3. Carregue o microeletrodo através da tubulação capilar, junção em T, cânula e ponteiras correspondentes.
4. Certifique-se de que a extremidade traseira do eletrodo se projete a menos de 1 cm da parte de trás do tubo capilar e a ponta do eletrodo se projete da cânula na distância desejada na parte inferior. A posição do eletrodo pode ser ajustada manualmente a partir da extremidade superior.
5. Solde um pino dourado no terminal do microeletrodo.
6. Adicione cola epóxi entre o pino dourado e a ponteira superior para prender o microeletrodo à ponteira.
7. Desaparafuse a ponteira superior para retrair a sonda dentro da cânula. Confirme visualmente se o microeletrodo está totalmente retraído para dentro da cânula.

3. Construção do Circuito Microfluídico (Figura 2)

1. Coloque uma placa de ensaio em uma superfície estável. Coloque as duas válvulas de três vias paralelas aos lados mais longos da placa de ensaio, cerca de 6 pol. separados, com uma porta (aquela que está sempre aberta) de frente uma para a outra. Use parafusos para fixar as válvulas na placa de ensaio.
2. Coloque uma régua ao lado das válvulas (para medir e rastrear o movimento dos fluidos dentro da tubulação capilar).
3. Coloque uma mistura de óleo de baixa viscosidade 1:1 e corante alimentar (marcador) na seringa estanque ao gás e coloque na bomba marcadora. Corte um pedaço de tubo capilar e use ponteiras padrão e conectores Luer-lock para conectar a seringa a uma das portas da válvula de entrada. Esta é a "linha marcadora".
4. Corte um pequeno pedaço de tubo capilar para a "linha da régua". Use ponteiras padrão para apertar as portas de face das válvulas.
5. Corte dois pedaços mais longos de tubo capilar para conectar a válvula de saída à microinjeção e para conectar a bomba de drogas à válvula de entrada (use ponteiras padrão).
   NOTA: O comprimento dessas duas linhas depende da configuração experimental, uma deve ser longa o suficiente para alcançar do aparelho de infusão ao animal e a outra da bomba de drogas à válvula de entrada. Use uma pedra de clivagem para cortar o tubo capilar.

4. Montagem do Microinjectrode no Microdrive (Figura 3)

1. Certifique-se de que o microeletrodo/sonda experimental esteja retraído na cânula antes da montagem.
   NOTA: O tubo guia deve estar em uma posição no microdrive.
2. Conecte um adaptador feito sob medida ao microinjetor.
3. Carregue a microinjeção através do tubo guia e prenda-a ao adaptador usando parafusos.
4. Meça a posição do microdrive (profundidade) na qual a microinjeção se projeta do tubo guia e, em seguida, retraia-a ~ 1 cm para se preparar para a inserção.
5. Para experimentos de microinfusão, conecte a "linha cerebral" à abertura da junção em T não utilizada do microeletrodo. Use uma ponteira padrão e aperte-a com uma chave de ponteira.

5. Lavagem e preparação do sistema microfluídico

1. Posicione o microdrive com a microinjeção sobre um copo de resíduos.
2. Carregue a clorexidina (por exemplo, nolvasan, dissolvido a 20 g/L) na seringa estanque a gás de 1 mL e coloque-a na bomba de medicamentos. Gire a direção do fluxo das válvulas de forma que o fluido passe da bomba de drogas através da válvula para a linha da válvula e saia pela "linha do cérebro".
3. Lave o circuito com clorexidina usando uma baixa vazão (50-200 μL/min) por um mínimo de 10 min. Repita as etapas 5.2 a 5.3 com solução salina estéril e depois arejado.
   NOTA: É importante verificar se há vazamentos neste stage. Aplique suavemente lenços sem fiapos nas junções para ajudar a revelar qualquer vazamento de líquido através das ponteiras.
4. Carregue o medicamento na seringa estanque a gás de 500 μL, comprima o ar e coloque na bomba de medicamentos. Fluxo a 50 μL / min até que algumas gotas fluam da microinjetora.
5. Mergulhe o tubo-guia em clorexidina (dissolvido a 20 g/L) por 15 min.
6. Gire a direção da válvula de saída em direção à "linha de lavagem". Avance a bomba Marker até que uma borda clara de cor e óleo seja observada na linha da régua. Certifique-se de que sempre haja óleo entre o medicamento e a cor para não misturar os dois materiais solúveis em água e perder a borda afiada entre eles. Marque a posição inicial desta linha de óleo/corante (com um pedaço de fita adesiva ou marcador).
7. Gire a direção da válvula de saída em direção à linha do cérebro.

6. Realização de gravação ou experimento de infusão

NOTA: As etapas de manuseio do animal variam de acordo com o laboratório e o experimento. As etapas a seguir devem ser realizadas após a configuração cirúrgica necessária e a preparação para expor a dura-máter. Após o experimento, todas as etapas pós-procedimento necessárias devem ser realizadas de acordo com os protocolos aprovados institucionalmente.

1. Conecte o microdrive à câmara de gravação. Abaixe o tubo-guia para penetrar na dura-máter.
   NOTA: O tubo-guia não deve penetrar além da dura-máter para evitar danos ao córtex.
2. Abaixe o microinjetor para cerca de 2 mm acima do local de registro / injeção no cérebro.
3. Aperte a ponteira superior (microeletrodo/biossensor saliente) e conecte os pinos dourados ao sistema de gravação. Continue avançando a microinjeção até o local alvo.
   NOTA: Lembre-se de incluir a distância que o microeletrodo se estende além da cânula nos cálculos.
4. Para experimentos de infusão, use a bomba de microsseringa manual para mover a coluna de óleo em 1 cm a cada 3 min (~ 60 nL / min). Uma vez que o volume desejado tenha sido infundido, mude a válvula de saída para a linha de lavagem.
   NOTA: O volume infundido varia de acordo com a espécie do modelo e a área do cérebro visada. Taxas de fluxo mais rápidas podem danificar o tecido neural.
5. Quando os experimentos estiverem concluídos, retraia a microinjeção dentro do tubo guia (deixe a sonda saliente). Em seguida, remova o microdrive para lavagem. Lave o sistema microfluídico para se preparar para a reutilização. nota: Em nossa experiência, a microinjeção durará vários usos se forem tomados os devidos cuidados. A qualidade do registro eletrofisiológico cai mais rápido do que a capacidade de injeção.

Resultados

Figura 1: Fabricação passo a passo de microinjetora. (um) Configuração para uso independente do sistema microfluídico. A cânula e a sonda são medidas para confirmar que a ponta da sonda pode ser projetada no comprimento desej...

Materiais

https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Válvulas manuais de 3 portas	Válvula seletora manual de 3 portas LabSmith (MV201-C360)	https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26
Cannulae	Vita Needle Company	304, diâmetro externo 228μm, diâmetro interno 165μm	https://www.vitaneedle.com/assets/files/Vita_Needle_Master_Tubing_Gauge_Chart.pdf
Pedra de clivagem	Molex	Pedra de clivagem 1" x 1" (peça nº 1068680064)	Altamente recomendado seguir o método de clivagem de tubos capilares: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf
Walmart	de diacetato de clorexidina	(AAP311)	Usado para lavagem de circuitos microfluídicos, dissolvido a 20 g/L
Adaptador personalizado	Adaptador		usinado personalizado para conectar o microinjetor ao microdrive
hidráulico	Driver LabSmith	T7 TORX para instalação de parafusos de placa de ensaio (Driver LS-TORX)	https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25
Cola epóxi	LabSmith	Adesivo epóxi de alta resistência em duas partes (LS-EPOXY) para colagem de metal e plástico	https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24
Virola	LabSmith	Encaixe de uma peça (C360-100) para conectar capilar, através do orifício dimensionado para capilar OD de 360μm<
		para uso em qualquer porta	-C360https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24
Chave de virola	LabSmith	1/8" chave hexagonal para instalação de conexões e plugs de peça única (LS-HEX 1/8" Hex Wrench)	Seringa estanque a gás https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24
	Hamilton Company	Seringa estanque a gás de 500μL modelo 1750 (81220) e seringa estanque a gás de 1mL modelo 1001 (81320)	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top Alfinetes de ouro Aim-Cambridge Masculino banhado a ouro
		pino do conector de crimpagem (40-9856M)	https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html
Toalhetes sem fiapos	Kimberly Clark	Kimtech Science Kimwipes Tarefa delicada	Toalhetes sem fiapos, usados para identificar vazamentos no sistema
Corante	alimentar líquidoMcCormick & Co.	Corante alimentar líquido preto à base de água (52100581873)	https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color
Óleo de baixa viscosidade	Clearco Products Co.	Fluido de silicone puro Octametiltrisiloxano com viscosidade de 1cSt a 25°C (PSF-1cSt)	http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html
Conector Luer-Lock	Adaptador LabSmith	Luer-Lock (C360-300), encaixe fêmea para conectar a seringa Luer Lock a um tubo capilar de 360μm	https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24
Micro brocas	Broca Grainger	Micro, 0,23 mm (414H85)	https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits
Microeletrodo	FHC	Microeletrodo de metal, tungstênio com isolamento	epóxihttps://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes
Micromanipulador hidráulico de óleo	Narishige Group	Micromanipulador hidráulico de óleo com tubo guia anexado (MO-96)	http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html
Tubulação capilar de sílica	Molex	Polymicro flexível (TSP150375), diâmetro externo 375μm, diâmetro interno 150μm	https://www.molex.com/webdocs/datasheets/pdf/en-us/1068150024_CAPILLARY_TUBING.pdf
Bomba de seringa programável	Bomba de infusão/retirada padrão do aparelho de Harvard, programável (70-2213)
Régua Empire		Aço inoxidável 6" Régua rígida (27303)	http://www.empirelevel.com/rulers.php Conjunto de
parafusos	LabSmith	Conjunto de parafusos de montagem de válvulas (LS-SCREWS .25), parafusos formadores de rosca (2-28 x 1/4") para montagem de válvulas em placa	de ensaiohttps://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24
Placa de ensaio padrão	LabSmith	4" x 6" plataforma (LS600), com espaçamento de furos de 0,25" para montagem do circuito	de fluidohttps://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24
Solução salina estéril (cloreto de sódio) 0,9%.	Baxter	0,9% Cloreto de Sódio estéril	Infusão Intravenosa Estéril
Filtros de seringa estéril	Millipore Sigma	MilliporeSigma™ Millex-GP™ Filtros de seringa estéril com membrana PES (SLGPM33RS)
Bomba de microsseringa manual Stoelting	Company	Bomba de infusão/retirada manual (51222)	https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html
T-junction	LabSmith	T de interconexão (C360-203) para combinar fluxos de fluxo, para uso com tubulação capilar de 360μm OD

Tubo de aço inoxidável Desinfetante de solução Nolvasana href='https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24'>https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24 Plugue de virola LabSmith Plugue de peça única (C360-101) fundida flexível https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs