Entrega de substâncias direcionadas ao cérebro do camundongo por meio de infusão na artéria carótida interna

Resumo

Fonte: Leda, A. R., et al. Técnica de infusão de microcirurgia de camundongo para entrega de substância direcionada no SNC através da artéria carótida interna. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra um procedimento microcirúrgico projetado para facilitar a infusão direcionada de uma substância de teste no cérebro através da artéria carótida interna (ACI). O procedimento envolve sutura precisa e manipulação vascular para restringir temporariamente o fluxo sanguíneo, garantindo uma entrega controlada. Um tubo capilar é inserido na artéria carótida externa (ECA) e avançado em direção à bifurcação. Após a infusão, a substância ignora a circulação sistêmica, atravessa a barreira hematoencefálica e atinge a entrega direcionada ao parênquima cerebral.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação de camundongos para cirurgia

1. Anestesie o camundongo com isoflurano misturado com oxigênio, usando um sistema de anestesia laboratorial. Use isoflurano na configuração entre 4-5% e fluxo de oxigênio a 2 L/min na máquina comercial (consulte a Tabela de Materiais). Transferir o animal para a superfície cirúrgica, sob um estereomicroscópio, e manter a anestesia usando um cone nasal (usar isoflurano configuração 1,5 - 2,5 e fluxo de oxigênio a 2 L/min).
   1. Certifique-se de que a frequência respiratória do camundongo esteja em torno de 1 - 2 respirações/s sem ofegar. Além disso, certifique-se de que o animal não apresente reação de estimulação de bigodes e reflexo pedal (pinça do dedo do pé). Monitore a frequência respiratória e o esforço durante a cirurgia, pelo menos a cada 5 minutos. Siga o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais específico e as diretrizes veterinárias para monitoramento de anestesia de roedores.
2. Aplique uma gota de lubrificante oftálmico em cada olho usando um cotonete estéril para evitar o ressecamento. Recomenda-se a administração de anti-inflamatórios e analgésicos para aliviar o desconforto.
3. Com o animal deitado de costas, mantenha a anestesia usando um cone nasal.
4. Limpe a área do pescoço do animal limpando a área três vezes com etanol 70% e clorexidina. Depile a área de cirurgia do animal usando uma navalha (detalhada abaixo).

2. Dissecção da Artéria Carótida Comum (CCA)

1. Realize todo o procedimento de microcirurgia sob um estereomicroscópio. Usando tesouras cirúrgicas e fórceps, faça uma incisão superficial na linha média do pescoço, acima do esterno até abaixo da mandíbula (cerca de 3 a 4 cm).
2. Usando uma pinça, separe cuidadosamente o tecido adiposo e conjuntivo para expor a traqueia.
3. Coloque um travesseiro (objeto redondo, com cerca de 0,5 cm de diâmetro) na parte de trás do pescoço do mouse para estender o pescoço, expondo ainda mais a área.
4. Separe o tecido usando um retrator de tecido ou ganchos.
5. No lado esquerdo da traqueia do animal, separe cuidadosamente o tecido conjuntivo para expor o CCA esquerdo.
6. Usando uma pinça, remova cuidadosamente todo o tecido conjuntivo para expor a bifurcação da CCA e o início das artérias carótidas externa e interna.

3. Preparação do CCA para Infusão de Substância

1. Insira dois segmentos de sutura de náilon (cerca de 1 cm cada) sob a artéria carótida externa (ECA), usando uma pinça.
2. Coloque um nó permanente no ponto mais alto possível do ECA.
3. No ponto mais baixo possível do ECA, imediatamente acima da bifurcação do CCA, coloque um nó removível. Este nó deve estar solto em comparação com o nó superior.
4. Feche o CCA usando um clipe de recipiente, no ponto mais baixo possível.
5. Feche a artéria carótida interna (ACI) usando um clipe de vaso.
6. Usando uma tesoura de mola de microdissecação, faça um pequeno corte no ECA (cerca de 2 mm), entre os dois nós.

4. Infusão de substâncias via ICA

1. Monte um sistema de infusão. Anexar 6 polegadas de tubo capilar (dimensões ideais: 2,5 mm x 1,2 mm) a uma seringa tuberculínica contendo 250 μl da substância a ser infundida (fármacos, patógenos, vesículas extracelulares, entre outros) e inserir a ponta capilar suavemente na incisão realizada na etapa 3.6.
2. Continue a deslizar pelo capilar até atingir um ponto médio entre a bifurcação e o clipe que fecha o CCA.
3. Amarre o nó ECA inferior. Verifique se o nó está solto o suficiente para permitir a fluidez capilar e apertado o suficiente para evitar vazamentos.
4. Remova o clipe do ICA.
5. Aplique pressão suavemente no pistão da seringa, permitindo a infusão da substância a aproximadamente 10 μl por segundo.

5. Procedimentos pós-infusão

1. Coloque o clipe de volta no ICA.
2. Remova cuidadosamente o tubo capilar.
3. Amarre completamente o nó ECA inferior.
4. Remova os clipes do ICA e do CCA.

6. Fechamento da incisão e cuidados pós-operatórios

1. Remova o afastador ou os ganchos de tecido e o travesseiro.
2. Limpe a área de sutura com solução salina estéril.
3. Feche a incisão com sutura/agulha de náilon e fórceps.
4. Administre anti-inflamatórios e analgésicos para aliviar o desconforto pós-operatório.
5. Coloque o animal em gaiola colocada em almofada de aquecimento por pelo menos 1 hora e monitore a recuperação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Instrumento de anestesia	Vetequip	901806
Tesoura cirúrgica	Fine Science Tool	14558-09
Pinça cirúrgica de ponta reta	Fine Science Tool	00108-11
Pinça cirúrgica ponta angular	Fine Science Tool	00109-11
Tesoura de mola	Fine Science Tool	15000-08
Sutura de nylon	Braintree Scientific	SUT-S 104
Tubo capilar (Micro-Renathane 0.010" x 0.005" per ft.)	Braintree Scientific	MRE01050
Sutura de fechamento	VWR	95057-036
Isoflurano	Piramal
2,3,5-Trifeniltetrazólio cloreto	FisherScientific	50-121-8005