Geração Experimental de Carcinoma Associado fibroblastos (FAC) de Fibroblastos Humanos mamária

Resumo

Carcinoma associado fibroblastos (FAC) rico em miofibroblastos presentes no estroma tumoral, desempenhar um papel importante na condução de progressão do tumor. Nós desenvolvemos um modelo coimplantation xengraft tumor para gerar FAC experimentalmente a partir de fibroblastos humanos mamária. O protocolo descreve como estabelecer miofibroblastos CAF que adquirem uma capacidade de promover tumourigenesis.

Resumo

Os carcinomas são tecidos complexo composto de células neoplásicas e um compartimento não-cancerosas referido como o 'estroma'. O estroma é composto de matriz extracelular (ECM) e uma variedade de células mesenquimais, incluindo fibroblastos, miofibroblastos, células endoteliais, pericitos e leucócitos ^1-3.

O estroma tumoral associado é sensível a sinais de substancial parácrinos liberados por células de carcinoma vizinhos. Durante o processo da doença, o estroma, muitas vezes torna-se povoado por carcinoma-associada fibroblastos (FAC), incluindo um grande número de miofibroblastos. Estas células foram previamente extraído de diversos tipos de carcinomas humanos para a cultura in vitro. A subpopulação de FAC é distinguível através da sua sobre-regulação de α-actina de músculo liso (α-SMA) expressão ^4,5. Essas células são uma característica da 'fibroblastos ativados "que compartilham propriedades semelhantes com miofibroblastos commonly observado em tecidos lesados ​​e fibrótico ^6. A presença desse grupo CAF miofibroblástica é altamente relacionada com alto grau de malignidade e associado com prognósticos pobres em pacientes.

Muitos laboratórios, inclusive o nosso, têm mostrado que FAC, quando injetados com células de carcinoma em ratos imunodeficientes, são capazes de promover substancialmente tumourigenesis ^7-10. FAC preparados a partir de pacientes com carcinoma, no entanto, freqüentemente sofrem senescência durante a propagação da cultura limitar a extensão da sua utilização em toda a experimentação em curso. Para superar esta dificuldade, desenvolvemos uma nova técnica para gerar experimentalmente imortalizado mamárias humanas linhas celulares CAF (exp-FAC) de fibroblastos humanos mamária, utilizando um modelo de mama coimplantation xenoenxerto tumor.

A fim de gerar exp-FAC, parental humano fibroblastos mamárias, obtidas a partir do tecido mamoplastia de redução, foram os primeiros immortalised com hTERT, a subunidade catalítica da telomerase holoenzima, e projetados para expressar um gene GFP e resistência puromicina. Essas células foram coimplanted com células MCF-7 de carcinoma de mama humano expressando um oncogene ras ativados (MCF-7-ras células) em um xenoenxerto mouse. Após um período de incubação in vivo, inicialmente injetados fibroblastos humanos mamária foram extraídos do xenoenxertos tumor com base em sua resistência puromicina ^11.

Observamos que o residente de fibroblastos humanos mamárias têm diferenciada, adotando um fenótipo miofibroblástica e adquirida tumor propriedades promotoras durante o curso da progressão do tumor. Importante, essas células, definidas como exp-FAC, imitam de perto o fenótipo do tumor de promoção miofibroblástica da FAC isolado de carcinomas de mama de pacientes dissecados. Nosso tumor xenoenxerto derivados exp-FAC, portanto, fornecer um modelo eficaz para estudar a biologia da FAC em Breas humanacarcinomas t. O protocolo descrito também pode ser estendido para a geração e caracterização de populações de vários CAF derivados de outros tipos de carcinomas humanos.

Protocolo

1. Isolamento da principal cultura de fibroblastos humanos normais mamárias

Procedimentos experimentais para isolar principal cultura de fibroblastos humanos normais mamárias são descritas na fig. 1A.

1. Prepare a célula tampão dissociação, como descrito anteriormente ^12: Médio Modified Dulbecco Águia (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FCS), a penicilina-estreptomicina (200 unidades / ml), colagenase tipo I (1 mg / ml) e hialuronidase ( 125 unidades / ml).
2. Lave o tecido mamário dissecada a partir de uma mamoplastia de redução (~ 0,5 grama) várias vezes em tampão fosfato salino (PBS). Picar o tecido em fragme....

Discussão

A falta de marcadores específicos CAF e do nível de heterogeneidade observada entre FAC tornar a caracterização deste tipo de célula um desafio em si mesmo. FAC estudar in vitro também tem sido dificultada pela complicação adicional de que essas células senesce e parar de proliferar quando cultivadas por um longo período. Nossa tentativa anterior de imortalizar diretamente FAC primário usando uma construção hTERT retroviral cDNA foi vencida. Portanto, para investigar o tumor promover propriedades dessas células.......

Materiais

Nome do material	Tipo	Companhia	Número Catálogo	Comentário
DMEM		Invitrogen	61965-026
Soro fetal bovino		GIBCO	10270
Penicilina-estreptomicina		Invitrogen	15140-122
Colagenase tipo I		Sigma	C0130-1G
hialuronidase		Sigma	H4272
Vimentina anticorpos (V9)		Novocastra Laboratories	NCL-L- VIM-V9
Tenascina C (BC-8) de anticorpos				um presente de Dr. Luciano Zardi
α-SMA-Cy3 anticorpos (1A4)		Sigma	C6198
Prolil-4-hidroxilase		Dako	M0877
(5B5) de anticorpos
Colágeno type1 anticorpos 1A		Sigma	HPA011795
Pan-citoqueratina de anticorpos		Sigma	C5992
Anticorpos fibronectina		BD Biosciences	610077
S100A4/FSP-1 (fibroblastos proteína-1 anticorpo específico)		Dako	A5114
Proteína de superfície de fibroblastos (Clone 1B10) anticorpos		Abcam	ab11333
MSCV-IRES-GFP construir				Pedido para os autores do
pBabe-puro construir				Compra de Addgene
Puromicina		Sigma	P8833
DAPI		Sigma	D9564
15 ml tubo cônico		Corning	430766
Camundongo nu		Taconic	NCRNU-F	Feminino NCr nua
Celas de C3H/10T1/2		ATCC		CCL-226