Geração Experimental de Carcinoma Associado fibroblastos (FAC) de Fibroblastos Humanos mamária

Resumo

Carcinoma associado fibroblastos (FAC) rico em miofibroblastos presentes no estroma tumoral, desempenhar um papel importante na condução de progressão do tumor. Nós desenvolvemos um modelo coimplantation xengraft tumor para gerar FAC experimentalmente a partir de fibroblastos humanos mamária. O protocolo descreve como estabelecer miofibroblastos CAF que adquirem uma capacidade de promover tumourigenesis.

Resumo

Os carcinomas são tecidos complexo composto de células neoplásicas e um compartimento não-cancerosas referido como o 'estroma'. O estroma é composto de matriz extracelular (ECM) e uma variedade de células mesenquimais, incluindo fibroblastos, miofibroblastos, células endoteliais, pericitos e leucócitos ^1-3.

O estroma tumoral associado é sensível a sinais de substancial parácrinos liberados por células de carcinoma vizinhos. Durante o processo da doença, o estroma, muitas vezes torna-se povoado por carcinoma-associada fibroblastos (FAC), incluindo um grande número de miofibroblastos. Estas células foram previamente extraído de diversos tipos de carcinomas humanos para a cultura in vitro. A subpopulação de FAC é distinguível através da sua sobre-regulação de α-actina de músculo liso (α-SMA) expressão ^4,5. Essas células são uma característica da 'fibroblastos ativados "que compartilham propriedades semelhantes com miofibroblastos commonly observado em tecidos lesados ​​e fibrótico ^6. A presença desse grupo CAF miofibroblástica é altamente relacionada com alto grau de malignidade e associado com prognósticos pobres em pacientes.

Muitos laboratórios, inclusive o nosso, têm mostrado que FAC, quando injetados com células de carcinoma em ratos imunodeficientes, são capazes de promover substancialmente tumourigenesis ^7-10. FAC preparados a partir de pacientes com carcinoma, no entanto, freqüentemente sofrem senescência durante a propagação da cultura limitar a extensão da sua utilização em toda a experimentação em curso. Para superar esta dificuldade, desenvolvemos uma nova técnica para gerar experimentalmente imortalizado mamárias humanas linhas celulares CAF (exp-FAC) de fibroblastos humanos mamária, utilizando um modelo de mama coimplantation xenoenxerto tumor.

A fim de gerar exp-FAC, parental humano fibroblastos mamárias, obtidas a partir do tecido mamoplastia de redução, foram os primeiros immortalised com hTERT, a subunidade catalítica da telomerase holoenzima, e projetados para expressar um gene GFP e resistência puromicina. Essas células foram coimplanted com células MCF-7 de carcinoma de mama humano expressando um oncogene ras ativados (MCF-7-ras células) em um xenoenxerto mouse. Após um período de incubação in vivo, inicialmente injetados fibroblastos humanos mamária foram extraídos do xenoenxertos tumor com base em sua resistência puromicina ^11.

Observamos que o residente de fibroblastos humanos mamárias têm diferenciada, adotando um fenótipo miofibroblástica e adquirida tumor propriedades promotoras durante o curso da progressão do tumor. Importante, essas células, definidas como exp-FAC, imitam de perto o fenótipo do tumor de promoção miofibroblástica da FAC isolado de carcinomas de mama de pacientes dissecados. Nosso tumor xenoenxerto derivados exp-FAC, portanto, fornecer um modelo eficaz para estudar a biologia da FAC em Breas humanacarcinomas t. O protocolo descrito também pode ser estendido para a geração e caracterização de populações de vários CAF derivados de outros tipos de carcinomas humanos.

Protocolo

1. Isolamento da principal cultura de fibroblastos humanos normais mamárias

Procedimentos experimentais para isolar principal cultura de fibroblastos humanos normais mamárias são descritas na fig. 1A.

1. Prepare a célula tampão dissociação, como descrito anteriormente ^12: Médio Modified Dulbecco Águia (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FCS), a penicilina-estreptomicina (200 unidades / ml), colagenase tipo I (1 mg / ml) e hialuronidase ( 125 unidades / ml).
2. Lave o tecido mamário dissecada a partir de uma mamoplastia de redução (~ 0,5 grama) várias vezes em tampão fosfato salino (PBS). Picar o tecido em fragmentos pequenos (<1,5 mm ³⁾ com lâminas de barbear estéril.
3. Transferir os fragmentos de tecido em um tubo cônico de 15 ml contendo uma quantidade adequada de células acima dissociação buffer (10 ml por 0,5 grama de tecido) e vortex por 1 min em velocidade máxima.
4. Digerir os fragmentos de tecido na célula dissociação tampão f18/12 h ou a 37 ° C com agitação lenta. ^* Nota que haverá ainda muitos pedaços de fragmentos de tecido não digerida restante no tubo.
5. Incubar o tubo por 5 min à temperatura ambiente sem agitação. Transferência resultante do estroma celular enriquecido sobrenadante para um novo tubo cônico com uma pipeta de 5 ml sorológicos.
6. Centrífuga a fração estromal por 5 min a 250 X g e ressuspender o sedimento celular em PBS. Centrifugar novamente por 5 min a 250 X g e ressuspender o pellet celular em DMEM suplementado com 10% SFB. Cultura as células em DMEM contendo 10% SFB em um prato de 15 centímetros de Petri a 37 ° C e dióxido de carbono de 5%.
7. Propagar as células até confluentes. Pode levar 80-10 dias. Armazenar as células a -80 ° C, utilizando meio de congelamento (10% dimetil sulfóxido e FCS de 20% em DMEM). Prepare 5 frascos congelados como um estoque original. Descongelar um frasco e expandir as células para preparar 5 frascos para a secundária de ações contendo fibroblastos várias passagens dentro de 5 a populaçãoduplicações (PDs) para os experimentos subseqüentes. Estes procedimentos minimizar seleção clonal e estresse cultura que poderia ocorrer durante a cultura de tecidos estendidos. ^* Nota: P1.1-7 também podem ser usados ​​para isolar FAC de carcinomas de mama obtidos por uma mastectomia ^12.

2. Geração de GFP-etiquetadas, puromicina resistente, imortalizado humano normal fibroblastos mamárias

1. Para imortalizar o principal fibroblastos humanos normais mamárias isoladas em P1.7), introduzir um pMIG retroviral (MSCV-IRES-GFP) vector ^12, expressando tanto hTERT e GFP. Cultura das células para os dias 05/04 e, em seguida, classificar a GFP células positivas por citometria de fluxo.
2. Introduzir uma retroviral pBabe-puro construir codificação de um gene de resistência puromicina para os fibroblastos GFP-etiquetadas imortalizado. Cultura das células durante 5-7 dias na presença de puromicina (concentração final: 1 mg / ml) para isolar a GFP-positivo (GFP +), puromicina-resistente ^(R puro
3. Em seguida, examinar se esses fibroblastos produzem vírus ativo, o que pode levar à transferência horizontal de genes que codificam GFP e resistência puromicina, crescer 2.5x10 ⁵ GFP + puro ^R imortalizado fibroblastos humanos mamária em uma placa de Petri seis centímetros por 2 dias.
4. Meio filtrante condicionada por estes fibroblastos utilizando um filtro de seringa (tamanho dos poros: 0,45 mm) e adicioná-lo em 10T1 / 2 células de camundongos fibroblástica por 12h na presença de sulfato de protamina (5 mg / ml), que aumenta a eficiência da infecção pelo vírus. O meio é, então, alterado para 10% FCS-DMEM por mais 2 dias.
5. Examine as células por uma microscopia de fluorescência. 10T1 / 2 células infectadas pelo vírus da GFP se tornará GFP-positivo. Também tratar as células com puromicina (1 mg / ml) por 5-7 dias e observar a placa se houver puro ^R 10T1 / 2 células são colônias presentes e forma após o tratamento puromicina.
6. Note que o gene horizontal transfer por vírus ativo produzido pelo GFP parental puro + ^R fibroblastos humanos mamárias pode tornar as células ao redor murino e / ou carcinoma de células GFP + ^R puro dentro xenoenxertos tumor. Isto pode dificultar os processos de isolar a GFP inicialmente injetado + puro ^R fibroblastos humanos mamárias da xenoenxertos tumor.

3-A. Coinjection de fibroblastos humanos com células mamárias carcinoma de mama em um mouse imunodeficientes

Procedimentos experimentais para a geração de exp-FAC são ilustrados na figura. 1BA.

1. Mix 1x10 ⁶ MCF-7-ras células de carcinoma de mama humano e 3x10 ⁶ GFP ^{+ R} puro, imortalizado fibroblastos humanos mamárias gerada em P2.2). Prepare as células em 400 mL de meio de cultura com 50% (v / v) Matrigel por injeção.
2. Injete a mistura de células por via subcutânea em um mouse imunodeficientes nude. Quando FAC são extraídos de forma independente a partir de diferentestumores, implantes cada mistura em flancos direito e esquerdo de vários ratos.

3b. Injeção de fibroblastos humanos mamárias em um mouse imunodeficientes

1. Para gerar fibroblastos controle contra exp-FAC, prepare 3x10 ⁶ GFP ⁺ puro ^R imortalizado fibroblastos humanos mamárias gerada em P2.2 em 400 mL de meio de cultura com 50% (v / v) Matrigel por injeção (Fig. 1BB). NÃO misturar os fibroblastos com células de carcinoma.
2. Implante os fibroblastos preparado em P3b.1 em sites subcutânea de camundongos nude.

^* Note-se que os fibroblastos inoculados formarão o tecido fibroblástico tumor, mas não sob a pele.

4a. Dissecção do tumor xenoenxerto

1. Eutanásia o mouse abrigar um subcutânea humana xenoenxerto de câncer de mama 42 dias pós-implantação (Fig. 1BA). ^* Nota que, quando células de carcinoma outros e / ou fibroblastos são coimplanted, Fibroblastos podem precisar de ser incubadas por mais de 42 dias dentro do xenoenxerto tumor para iniciar seu fenótipo miofibroblástica.
2. Colheita do xenoenxerto tumor do flanco do mouse por dissecção romba com a pinça e tesoura. Mergulhe o tecido tumoral em PBS.

4b. Dissecação de xenoenxerto fibroblastos

1. Eutanásia o mouse abrigar o xenoenxerto de fibroblastos 42 dias pós-implantação (Fig. 1BB).
2. Dissecar o xenoenxerto de fibroblastos subcutânea usando uma pinça e tesouras. Coloque o tecido fibroblástico em PBS. ^* Nota que um xenoenxerto de fibroblastos, que aparece como um tecido transparente pequena, pode ser difícil encontrar sob a pele.

5. Preparação de células primárias cultivadas a partir de xenoenxertos

1. Use um gabinete de biossegurança estéril para dissecar o tumor (~ 0,5 grama) ou tecido fibroblástico (~ grama 0,1). Transferir os tecidos extirpados para o topo de uma cultura de 15 centímetros dish com 1 ml de PBS. Picar os tecidos em fragmentos de tecido pequenos (<1,5 mm ³⁾ com lâminas de barbear estéril. * Observe que se o xenoenxerto de fibroblastos pesa menos de 0,1 grama, recolher alguns xenoenxertos fibroblastos adicionais e misturá-los juntos para aumentar o número de células para isolamento.
2. Transferir os fragmentos de tecido em um tubo cônico de 15 ml que contém a célula dissociação buffer (10 ml por 0,5 grama de tecido) e vortex por 1 min em velocidade máxima.
3. Incubar a suspensão de células por 3 horas a 37 ° C com agitação lenta e contínua.

6. Isolamento de puromicina resistentes células em cultura

1. Centrifugar a suspensão de células dissociadas a partir de fibroblastos de tumor ou xenoenxerto por 5 min a 250 X g e ressuspender o pellet celular em PBS. Centrifugar novamente por 5 min a 250 g. X Ressuspender o pellet celular, resultando em 10% FCS-DMEM. Cultura as células em um prato de 15 centímetros de petri na presença de puromicina (1 mg / ml) a 37 ° Ce dióxido de carbono de 5%, a fim de eliminar quaisquer células de carcinoma contaminação e / ou murino células do estroma. Propagar as células até confluentes (2-4 semanas). Armazenar as células a -80 ° C, utilizando meio de congelamento. * Observe que o resultado puro células ^R, designado exp-Caf1 de 42 dias de idade (Fig. 1BA) ou controle de fibroblastos-1 células (Fig. 1BB), são imortais e positivas para GFP. É recomendável verificar se essas células produzem vírus ativo usando 10T1 / 2 células, como descrito em P2.3-6.

7a. Isolamento de exp CaF2-células em cultura

Para impulsionar ainda mais o fenótipo ativado miofibroblástica da FAC, misture os 42 dias de idade exp-Caf1 células com MCF-7-ras células e injetá-las novamente por via subcutânea em um rato nu por períodos adicionais de 200 dias. Dissecar e dissociar a xenoenxerto tumor em uma suspensão de uma única célula e cultura as células em um prato de 15 centímetros de Petri com 10% FCS-DMEM, na presença de puromicina (1 mg / ml), como indicado na P6.1. Propagar as células até confluentes (8-10 dias). Armazenar as células a -80 ° C, utilizando meio de congelamento. O resultado células são nomeadas puro ^R 242 dias de idade exp-CaF2 células (Fig. 1BA).

7b. Extração de controle de fibroblastos-2 células em cultura

Para gerar fibroblastos controle contra exp-CaF2 células, injetar 42 dias de idade controle de fibroblastos-1 células sozinho, sem células de carcinoma por via subcutânea em um rato nu adicionalmente para 200 dias. Dissecar e dissociar o tecido fibroblástico em uma suspensão de células individuais e cultura as células em um prato de 15 centímetros de Petri com 10% FCS-DMEM, na presença de puromicina (1 mg / ml), conforme indicado em P6.1. Propagar as células até confluentes (3-4 semanas). Armazenar as células a -80 ° C, utilizando meio de congelamento. O resultado células puro ^R são nomeados de fibroblastos-2 controle de células (Fig. 1BB).

8. Resultados representativos:

Controle de fibroblastos-2 e exp-CaF2 cells, que foram extraídos de tumor de mama xenoenxertos, corados fortemente positiva para marcadores mesenquimais, incluindo humanos específicos vimentina, prolil-4-hidroxilase, 1A colagénio, fibronectina, S100A4, e proteína de superfície de fibroblastos (Fig. 2A) ^11, indicando humana origem ea natureza dessas células mesenquimais. Em contraste, a citoqueratina, um marcador de células epiteliais, não foi manchado nestes ⁺ GFP fibroblastos (Fig. 2B). Esses achados, portanto, sugerem que o extraído exp CaF2 e controle de fibroblastos-2 células ter se originado a partir da dos pais humanos fibroblastos mamárias, inicialmente introduzido xenoenxerto mouse.

Importante, uma maior proporção de exp-CaF2 células coradas positivas para α-SMA e da glicoproteína da matriz extracelular tenascina-C ^5, sendo que ambos são marcadores de miofibroblastos em comparação com 42 dias de idade exp Caf1 e controle de fibroblastos-2 células (Fig . 2C, D) ^11. Estes dados indicam que fibr humana residente mamáriasoblasts progressivamente evoluir para miofibroblastos CAF dentro xenoenxertos tumor.

Figura 1 Representação esquemática do isolamento de fibroblastos humanos mamária. A) O tecido mamoplastia de redução foi picada utilizando lâminas de barbear estéril (P1.2) e transferido para um tubo cônico de 15 ml (P1.3). Os pequenos fragmentos de tecido foram digeridos na célula dissociação buffer (P1.4) e preparado para a cultura in vitro (P1.5-7). Para imortalizar o isolado humanos primários fibroblastos mamárias, uma pMIG retroviral (MSCV-IRES-GFP) vector, expressando tanto hTERT e GFP, foi introduzido, ea GFP-positivos resultantes células foram classificados usando citometria de fluxo (P2.1). Um vetor pBabe puro-retroviral codificação de um gene de resistência puromicina foi, então, introduzidos nessas células. Após o tratamento puromicina, GFP-etiquetadas (GFP ⁺⁾ puromicina-resistente (Puro ^R), immortalised fibroblastos humanos mamária foram isolados (P2.2).

Ba) Para gerar exp-FAC, GFP ⁺ puro ^R imortalizado fibroblastos humanos mamária foram coinjected com MCF-7-ras células de carcinoma de mama por via subcutânea em um mouse imunodeficientes nude (P3a). O xenoenxerto tumor foi retirado em 42 dias após a implantação (P4a) e dissociada em uma suspensão de uma única célula (P5). Essas células foram então cultivadas in vitro na presença de puromicina para eliminar qualquer contaminação e células de carcinoma de células do estroma do mouse (P6). O resultado puromicina resistentes células foram denominadas experimentalmente gerados Caf1 (exp-Caf1) células. Estas células, ressecadas 42 dias pós-implantação, foram mais uma vez misturado com MCF-7-ras células e implantado por via subcutânea em um rato de acolhimento, como antes (P7a). O tumor resultante foi permitido crescer por períodos adicionais de 200 dias, em seguida, dissecado, dissociado, e cultivadas na presença de puromicina. O isoladopuromicina resistentes células foram denominadas células-exp CaF2 (242 dias de idade).

Bb) Para isolar as células controle contra exp-FAC, GFP ⁺ puro ^R imortalizado fibroblastos humanos mamárias foram injetados em um rato nu como culturas puras sem MCF-7-ras células (P3b). O tecido fibroblástico, dissecados 42 dias pós-implantação (P4B), foi dissociada em uma única célula suspensões (P5) e puromicina resistentes células, chamado de controle de fibroblastos-1 células, foram isoladas como descrito anteriormente (P6). Esses fibroblastos foram mais uma vez implantado no subcutâneo em um rato nu sem MCF-7-ras células adicionalmente para 200 dias (p7b). O tecido fibroblástico foi dissecada, dissociado, e cultivadas na presença de puromicina. O isolado puromicina resistentes células foram denominadas de fibroblastos-2 controle de células (242 dias de idade).

Figura 2 (B) Em contrapartida, pan-citoqueratina, um marcador de células epiteliais , não é detectado no exp-CaF2 células expressando GFP (verde). Núcleos das células são coradas com 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (azul). Barra de escala, 50 mm (designado de Kojima et al. ¹¹⁾

(C) imunofluorescência de exp-CaF2 células fibroblasto-2 e controle de células (controle f.), utilizando anticorpos contra α-SMA (vermelho) ou tenascina-C (TN-C) (vermelho). Núcleos das células são coradas com DAPI (azul). Barra de escala, 50 mm. (D) 48% de exp-CaF2 células mancha positiva para α-SMA, enquanto que um4% de 42 dias de idade exp-Caf1 e 2,5% do controle populações de fibroblastos-2 de células positivas para α-SMA. (Referido a partir de Kojima et al.11)

Discussão

A falta de marcadores específicos CAF e do nível de heterogeneidade observada entre FAC tornar a caracterização deste tipo de célula um desafio em si mesmo. FAC estudar in vitro também tem sido dificultada pela complicação adicional de que essas células senesce e parar de proliferar quando cultivadas por um longo período. Nossa tentativa anterior de imortalizar diretamente FAC primário usando uma construção hTERT retroviral cDNA foi vencida. Portanto, para investigar o tumor promover propriedades dessas células...

Materiais

Nome do material	Tipo	Companhia	Número Catálogo	Comentário
DMEM		Invitrogen	61965-026
Soro fetal bovino		GIBCO	10270
Penicilina-estreptomicina		Invitrogen	15140-122
Colagenase tipo I		Sigma	C0130-1G
hialuronidase		Sigma	H4272
Vimentina anticorpos (V9)		Novocastra Laboratories	NCL-L- VIM-V9
Tenascina C (BC-8) de anticorpos				um presente de Dr. Luciano Zardi
α-SMA-Cy3 anticorpos (1A4)		Sigma	C6198
Prolil-4-hidroxilase		Dako	M0877
(5B5) de anticorpos
Colágeno type1 anticorpos 1A		Sigma	HPA011795
Pan-citoqueratina de anticorpos		Sigma	C5992
Anticorpos fibronectina		BD Biosciences	610077
S100A4/FSP-1 (fibroblastos proteína-1 anticorpo específico)		Dako	A5114
Proteína de superfície de fibroblastos (Clone 1B10) anticorpos		Abcam	ab11333
MSCV-IRES-GFP construir				Pedido para os autores do
pBabe-puro construir				Compra de Addgene
Puromicina		Sigma	P8833
DAPI		Sigma	D9564
15 ml tubo cônico		Corning	430766
Camundongo nu		Taconic	NCRNU-F	Feminino NCr nua
Celas de C3H/10T1/2		ATCC		CCL-226