Transplante Transnasal de Células Microgliais Humanas Derivadas de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas no Cérebro de Camundongos

Resumo

Fonte: Parajuli, B., et.al. Transplante de microglia derivada de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos no cérebro de camundongos imunocompetentes por via transnasal não invasiva. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra o transplante transnasal de células da microglia humana derivada de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSMG) em um cérebro de camundongo. A hialuronidase é aplicada nas narinas de um camundongo com depleção microglial para aumentar a permeabilidade. A suspensão de iPSMG é administrada por via intranasal e o camundongo pode se recuperar. Meios ricos em fatores de crescimento são administrados regularmente para apoiar a sobrevivência do iPSMG no tecido cerebral.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação do meio celular, meio de transplante e mistura anestésica

1. Prepare o meio celular adicionando 10% de soro fetal bovino e 0,1% de penicilina/estreptomicina no meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM).
2. Prepare o meio de transplante adicionando o fator estimulador de colônias humanas 1 ou hCSF1 (250 ng/mL) e o fator de crescimento transformador humano beta 1 ou hTGF-β1 (100 ng/mL) ao meio celular.
3. Prepare a mistura anestésica para injeção intraperitoneal misturando 0,45 mL de cloridrato de medetomidina, 1,2 mL de midazolam e 1,5 mL de tartarato de butorfanol em 11,8 mL de solução salina normal.

2. Preparação de células de microglia humana derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSMG)

NOTA: O iPSMG congelado (Tabela de Materiais) foi mantido a -80 ° C até o uso.

1. Descongele rapidamente as células congeladas em banho-maria a 37 °C. Agite as amostras até que todo o gelo visível derreta.
2. Adicione a microglia humana derivada de células-tronco pluripotentes induzidas descongeladas (iPSMG) aos meios de cultura aquecidos a 37 °C. Adicione 1 mL de células descongeladas contendo meio (1 × 10⁶ células) a 10 mL do meio de cultura.
3. Centrifugue as células a 300 x g por 5 min para obter um pellet de célula.
4. Após centrifugação, remova todo o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. A remoção completa do sobrenadante é desejável para reduzir a diluição da concentração de citocinas no meio de transplante.
5. Adicione o meio de transplante para obter uma concentração celular de 1 x 10⁵ células/μL.
6. Coloque o iPSMG no gelo e prossiga imediatamente para o transplante.
   NOTA: A preparação do iPSMG para transplante é realizada em uma bancada limpa para evitar contaminação.

3. Preparação do camundongo para transplante transnasal (Tsn)

1. Alimente os camundongos machos do tipo selvagem (C57BL/6J, 8 semanas de idade) com uma dieta contendo PLX5622 por 7 dias.
2. Ao final do^7º dia, cessar a dieta PLX e alimentar os camundongos com uma dieta normal até o final do estudo.
   NOTA: PLX5622 dieta contendo é preparada adicionando 1,2 g de PLX5622 em 1 kg de AIN-93G (Tabela de Materiais).

4. Transplante transnasal de células

1. 24 h após a cessação da alimentação com PLX, pesar os camundongos e anestesiar-os com uma injeção intraperitoneal da mistura anestésica (0,2 mL / 20 g).
2. Depois que os camundongos estiverem completamente anestesiados, conforme avaliado pela falta de resposta ao reflexo de retirada do pedal (pinça firme do dedo do pé), administre 2,5 μL de hialuronidase em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (100 U / mL), 1 h antes do transplante transnasal de iPSMG para cada narina duas vezes usando uma ponta de pipeta de 10 μL para aumentar a permeabilidade da mucosa nasal.
3. Após a aplicação da hialuronidase, coloque os camundongos em decúbito dorsal.
4. Repita a etapa 4.2 10 min antes do transplante transnasal de iPSMG.
5. Aplique 2,5 μL de suspensão celular em uma narina do camundongo usando uma ponta de pipeta de 10 μL.
6. Coloque o camundongo em decúbito dorsal por 5 minutos antes da administração da suspensão celular na outra narina.
7. Repita as etapas 4.5 e 4.6 quatro vezes, aplicando um volume total de 20 μL por animal.
8. Coloque o mouse em decúbito dorsal em uma almofada térmica a 37 °C até a recuperação da anestesia.
9. Às 48 h após a cessação da alimentação com PLX, repita as etapas 4.1-4.7 nos mesmos camundongos mais uma vez.
   NOTA: Deve-se notar que as células iPSMG são colocadas no gelo durante o transplante.

5. Aplicação de citocinas

1. Anestesiar os camundongos por uma injeção intraperitoneal de mistura anestésica (0,2 mL/20 g).
2. Aplique 2,5 μL do meio de transplante em uma narina do camundongo usando uma ponta de pipeta de 10 μL.
3. Coloque o camundongo em decúbito dorsal por 5 min antes de administrar o meio de transplante na outra narina.
4. Repita as etapas 5.2 e 5.3 quatro vezes, aplicando um volume total de 20 μL por animal.
   NOTA: Deve-se notar que a administração transnasal de meio de transplante (citocinas humanas) é necessária a cada 12 h para a viabilidade do iPSMG transplantado até o final do estudo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	10566
AIN 93G	Oriental Yeast Co
Fetal bovine	GE Healthcare Life Sciences	SH30070.03
Frozen iPSMG	Shionogi & Co., Ltd		Laboratório para Descoberta de Medicamentos e Pesquisa de Doenças
Fator estimulante de colônia humana 1 (hCSF1)	PeproTech	300-25
Hialuronidase	Sigma-Aldrich	H-3506
Cloridrato de medetomidina	Meiji Seika	VETLI5
Midazolam	Astellas	18005A2
Paraformaldeído	Wako Pure Chemical Industries	162-16065
Penicilina/estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Pipeta	Eppendorf	3120000011
Ponta de pipeta	Eppendorf	30076028
PLX5622	Amadis Chemical	A930097
Fator de crescimento transformador-β1 (Tgf-b1)	PeproTech	100-21

serum