Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Визуализация митохондриальной дыхательной функции использованием цитохрома C Оксидазы / сукцинатдегидрогеназы (ЦОГ / SDH) Дважды маркировки гистохимии

Published: November 23, 2011 doi: 10.3791/3266
Automatic Translation
1,2
1Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, 2National Institute on Drug Abuse (NIDA)

Summary

Цитохром с оксидазы / натрия дегидрогеназы (ЦОГ / SDH) двойной маркировки метод позволяет для прямой визуализации митохондриальных дыхательных ферментов недостатки в свежезамороженных срезах тканей. Это просто гистохимические техники и полезен в расследовании митохондриальных болезней, старения и связанных со старением заболеваний.

Protocol

1. Ткань подготовки к cryosectioning

  1. Жертва животного или шейки дислокации или обезглавливание, в соответствии с имеющимися этических разрешения.
  2. Быстро собирать тканей интерес (например,. Головной мозг), и быстро заморозить на сухом льду (ткани может потребовать замораживания в изопентан или пропан охлажденной жидким азотом для получения оптимального морфологии). Магазин тканей в алюминиевую фольгу при температуре -80 ° С до готовности разделе.
  3. Добавить замороженные ткани при подготовке к cryosectioning.
  4. Сбор 14-мкм разделы криостате при -21 ° C (возможно, потребуется скорректировать температуры ± 1-2 ° С). Оттепель разделы на слайдах использованием нагревательного блока, и хранить слайды без coverslipping при температуре -20 ° С до готовности к использованию.

2. ЦОГ гистохимии

  1. Разрешить слайды высохнуть при комнатной температуре в течение 1 часа. Положите слайды в режиме слайд-окрашивания камере с мокрым фильтровальной бумаги, нарезать полосками. Для получения consistenт результатов в каждом эксперименте, рекомендуется обрабатывать не более десяти слайдов на эксперимент, чтобы минимизировать время задержки.
  2. Подготовка под капот химические 1X DAB, 100 мкМ цитохром-с-в 0.1 М PBS рН = 7,0. Vortex быстро.
  3. Добавить 2 мкг бычьей каталазы (2 мкг мл -1 или около 4 МЕ мл -1). Хорошо перемешайте на вортексе, чтобы разбить все зерна каталазы.
  4. Применение 150 - 200 мкл инкубационной среды для каждого слайда, использование пипетки, чтобы равномерно распределить на все разделы.
  5. Инкубируйте слайды в течение 40 минут при температуре 37 ° C.
  6. Удалите излишки раствора из слайдов. Вымойте слайды 4 раза по 10 минут времени, в 0,1 М PBS рН = 7,0.
  7. Вернуться слайды в слайд-окрашивания камере мокрыми полосами бумаги.

3. SDH гистохимии

  1. Подготовка под капотом химических 1,5 мМ НБТ, 130 мМ сукцинат натрия, 0,2 мМ ПМС, и 1,0 мМ азид натрия в 0,1 М PBS рН = 7,0. Будьте осторожны, чтобы оградитьPMS от света месте. Vortex быстро.
  2. Применить 150-200 мкл инкубационной среды для каждого слайда, использование пипетки, чтобы равномерно распределить на все разделы.
  3. Инкубируйте слайды в течение 40 минут при температуре 37 ° C.
  4. Удалите излишки раствора из слайдов. Вымойте слайды 4 раза по 10 минут времени, в 0,1 М PBS рН = 7,0.
  5. Дегидрировать слайды на 2 минуты в следующих концентрациях этанола: 70%, 70%, 95%, 95%, 99,5%. Затем дайте 10 минут в дополнительных 99,5% шаг.
  6. Место слайды в ксилоле в течение 10 минут. Установить при помощи Entellan и покровное. Разрешить слайды для высыхания на ночь или, по крайней мере 1-2 часов в проветриваемом помещении.

4. Определение митохондриальная дисфункция

  1. Количество митохондриальной дисфункции указывается количество клеточного синего окрашивания. Для полу-количественного эти суммы, слайды должны быть закодированы и визуализируются при ярком микроскопии. Полу-количественное должны быть выполнены на слепого основе с использованием масштаба, например, с 0-4 (0, без синего окрашивания; 4, только синее окрашивание). Лучше всего для выполнения такого рода полу-количественная на нескольких участках от данного предмета / животного, чтобы вычислить среднее значение для каждого предмета / животного.
  2. Статистика должна проводиться с использованием непараметрических тестов, например, Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса.

5. Соответствующие управления специфичность

  1. Для контроля за специфики деятельности ЦОГ, повторите "ЦОГ гистохимии" шаги, и добавить 2,5 мМ азид натрия, цепи терминала дыхательных ингибитора.
  2. Для контроля за специфики деятельности SDH, повторите "SDH гистохимии" шаги с удалением натрия сукцината и добавлением 50 мМ малонат, конкурентный ингибитор SDH.
  3. Вымойте и обезвоживают секций в серии этанола, а затем смонтировать и покровное слайды как описано в пунктах 3.4 - 3.6.

6. Представитель Результаты:

палатка "> Общая схема ЦОГ / SDH двойной маркировки гистохимического анализа показано на рисунке 2. Типичные примеры соответствующих ЦОГ / SDH двойной маркировки гистохимии в мозге секций от дикого типа и преждевременно стареющих мышей мтДНК мутатор показаны на рисунке 3. темно-коричневой окраски в мышей дикого типа (рис. 3, слева) показал нормальную активность ЦОГ. Клетки с дыхательной цепи недостатков, обозначенных синей окраски, были выявлены в 12-недельным мышам мтДНК мутатор, и эти недостатки стали более широко, как мтДНК мутатор мышей в возрасте до 46 недель (рис. 3, в центре и справа).

Примеры неправильного ЦОГ / SDH двойной маркировки в мозгу секций от мышей дикого типа из-за недостаточной маркировки ЦОГ показано на рисунке 4. Недостаточное время инкубации для демонстрации активности ЦОГ, или снижение доступности молекулярного кислорода coverslipping слайдов во время инкубации, привело к уменьшению отложения DAB реагироватьионное произведение, и таким образом позволили образованию сине конечного продукта формазана во время инкубационного SDH.

ЦОГ и SDH деятельности можно исследовать по отдельности (рис. 5, слева и в центре), однако последовательная маркировка помогает в выявлении клеток с недостатками ЦОГ, в связи с образованием синего осадка при инкубации SDH (рис. 3, в центре и справа). Специфика управления в отношении ЦОГ и SDH деятельность также может быть сделано (рис. 5, справа).

Рисунок 1
Рисунок 1. Митохондриальной дыхательной комплексы IV. Дыхательной цепи митохондрий находится в пределах внутренней мембране и включает в себя пять комплексов. Целью дыхательной цепи для транспортировки электронов от комплекса я к IV и при этом он создает протонный градиент через внутреннюю мембрану используется комплекс V (АТФазы), чтобы произвести АТФ. Красный represe шестиугольниковнт субъединиц, кодируемых мтДНК. Белый шестиугольников представляют субъединиц, кодируемых ядерной ДНК (заметим, что комплекс II полностью закодирован от ядерного генома). Таким образом, мутации в митохондриального генома может привести к дисфункции дыхательной цепи из-за мутации в подразделениях органов дыхания цепных комплексов.

Рисунок 2
Рисунок 2. Блок-схема ЦОГ / SDH двойной маркировки гистохимического анализа. Рассеките органов интерес, быстро заморозить ткани на сухом льду, и хранить их при - 80 ° C. Сбор криостат разделов и хранить при - 20 ° C до использования. Разрешить разделы высохнуть на воздухе при комнатной температуре в течение 1 часа. Подготовка среду инкубации для гистохимии КОКС, применить его к слайдам и инкубировать 40 минут при температуре 37 ° C. Вымойте секций в 4 раза PBS в течение 10 минут каждого мытья. Подготовка среду инкубации для гистохимии SDH, применить его к SLIде, и снова инкубировать 40 минут при температуре 37 ° C. Вымойте разделы снова в PBS, обезвоживают в серии этанола, а затем смонтировать и покровное слайдов. ЦОГ / SDH дважды помечены разделы готовы, чтобы просмотреть при ярком микроскопии в течение 1-2 часов.

Рисунок 3
Рисунок 3. Типичными примерами ЦОГ / SDH двойной маркировки. Мозг секций от дикого типа и преждевременно стареющих мышей мтДНК мутатор были последовательно маркировку, указывающую на ЦОГ и SDH деятельности. (Масштаб по сайту:. 200 мкм) Нормальная активность ЦОГ (обозначены темно-коричневого цвета) было показано в гиппокампе от мышей дикого типа (слева). ЦОГ недостатков (обозначен синим цветом) были выявлены в гиппокампе мышей от мтДНК мутатор (в центре и справа). Существовал дальнейшее снижение активности ЦОГ на 46-недельного возраста, в мтДНК мышей мутатор, предлагая широкое обострение дыхательной дисфункции цепи. Наблюдается митоchondrial дисфункции у мышей мтДНК мутатор 12 вызвано высокими уровнями точечных мутаций мтДНК, а также повышение уровня линейных удалений 5.

Рисунок 4
Рисунок 4. Примеры неправильного ЦОГ / SDH двойной маркировки. Мозг секций от мышей дикого типа были последовательно маркировку, указывающую на ЦОГ и SDH деятельности. (Масштаб по сайту:. 200 мкм) Недостаточное время инкубации (10 и 25 минут) для демонстрации активности ЦОГ привело к уменьшению отложения продукта реакции коричневый DAB, по сравнению с 40-минутной инкубации времени (слева и в центре). Короткий инкубационный раз позволили образованию сине конечного продукта формазана во время инкубационного SDH, ошибочно предполагая наличие клеток с недостатками ЦОГ. Coverslipping слайдах во время инкубационного ЦОГ также привело к неточным образование и отложение DAB реагироватьионное произведение (справа).

Рисунок 5
Рисунок 5. Я ndividual ЦОГ и SDH маркировки и специфику управления. Мозг секций от мышей дикого типа были отдельно помечены для ЦОГ и SDH деятельности, указывает темно-коричневый цвет и синий цвет, соответственно (слева и в центре). Хотя ЦОГ и SDH деятельности могут быть снабжены индивидуальными этикетками, последовательной маркировки оказалось выгодным в расположении клеток с митохондриальной дисфункцией. Примером специфика управления ЦОГ и SDH деятельности в мозг от дикого типа мышей показало отсутствие маркировки (справа). (Масштаб по сайту:. 200 мкм)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Комбинированный ЦОГ / SDH гистохимические метод позволяет визуализации клеток с митохондриальной дисфункцией. Этот метод, с ранних исследований, начиная с 1968 года, остается популярным, и многие считая его «золотым стандартом» для выявления митохондриальных заболеваний у пациентов, 14,19,26,27. В настоящее время часто используется для исследования митохондриальной ДНК мутации управляемой старения и старения расстройств, связанных с 12,13,18,20,21,24. ЦОГ / SDH двойной маркировки метод часто используется в сочетании с другими методами определить конкретные мутации мтДНК и для дальнейшего изучения митохондриальных дыхательных ферментов, таких как oximetric измерений и спектрофотометрического анализа фермента 28,29.

Несмотря на свою давнюю использования, важных деталей, простое управление, специфичности и достижений для улучшения метод еще не был представлен. Что касается обработки тканей, важно использовать свежезамороженные ткани с этим techniqие, потому что, хотя ЦОГ выживет формалина фиксации, SDH не будет. Хотя это ограничение технику, ни посмертного задержка была найдена вмешиваться в этот метод 24 лет, но предполагается, для быстрого удаления органов, представляющим интерес для сохранения морфологии. Тем не менее, непрерывное циклов замораживания-оттаивания тканей и разделов следует избегать. Образцы тканей могут быть заморожены на сухом льду, однако, некоторые ткани может потребовать замораживания в изопентан или пропан, охлаждаемую жидким азотом, чтобы получить оптимальные морфологии и, чтобы избежать замерзания артефактов. Соответствующий толщине криостат разделы, в зависимости от типа ткани, также должны быть определены. Рекомендуется собирать в период с 8 - 14-мкм разделов, достаточно тонкий для проникновения решений, но достаточно толстым, чтобы сохранить анатомические особенности после обезвоживания. Предложил криостат температуре -21 ° C, возможно, должны быть скорректированы ± 1-2 ° C. Если образец слишком холодно, раздел может скручиваться, еслион слишком теплый, раздел может прилипнуть к ножом. Что касается обработки слайдов, использование смазки перо, которое часто полезно в сохранении среды инкубации на слайде, следует избегать. Вместо этого, используйте 150 - 200 мкл инкубационной среды на слайд, в зависимости от количества секций. Использование покровного во время инкубации следует избегать, пока слайд готов к установке, потому что молекулярный кислород должен присутствовать во время шага ЦОГ маркировки (рис. 4). Наконец, предлагается использовать имеющиеся в продаже DAB решения (например, Sigma), безопасная альтернатива подготовки DAB решение от кристаллического вещества. DAB решение также может быть изготовлена ​​из доступных таблеток, но несовместимы маркировки ЦОГ результаты были получены, когда эта таблетка основе DAB раствор.

Чтобы получить последовательные и надежные результаты этого биохимического анализа, следующие моменты рекомендуется. Используйте свежеприготовленные PBS и этанола в каждой экспериментальнойтонна Подготовка растворы цитохрома с, НБТ, ПМС (щит от света), сукцинат натрия, азид натрия, и малоната в 0.1 М PBS рН = 7,0, регулируя рН до 7,0 с 0,1 М HCl или 0,1 М NaOH. Алиготе и хранить растворы при температуре -20 ° С и быстро таять решения непосредственно перед использованием. Для получения устойчивых результатов в каждом эксперименте, рекомендуется обрабатывать не более десяти слайдов на эксперимент, чтобы минимизировать время задержки. Существует некоторая изменчивость между экспериментами, поэтому разделы от каждого субъекта / животное следует повторять по меньшей мере три-четыре раза, и соответствующие меры контроля должны использоваться в каждом эксперименте. Наконец, в качестве времени инкубации влияют количество ЦОГ-маркировки (рис. 4, левой и средней панели) и SDH-маркировку, это не рекомендуется изменять время инкубации более чем на 5% (2 мин).

Комбинированный ЦОГ / SDH протокол, представленные здесь, основаны на принципах описанных ранее 9,22,23,25. Как и вмногие technqiues, вариации этого протокола, например, исключение того ПМС и азид натрия, используя водный mountant, и различные инкубации и промыть раза, существуют и могут работать одинаково хорошо.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Работа выполнена при поддержке Национального института старения (AG04418), Национальный институт по злоупотреблению наркотиками, Национальный Институт Здоровья-Каролинского института Высшей Программа партнерства Каролинского института, шведского исследовательского совета, шведский Питание мозга, и шведский фонд мозга. Большое спасибо Маттиас Карлен и доктор Джузеппе Coppotelli для творческой поддержки с рисунком 1 и 2 соответственно; Карин Pernold для оказания технической помощи, а также д-ра. Барри Дж. Хоффер, Ларс Олсон, и Нильс-Горан Ларссон на протяжении большей полезные советы и обсуждения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dry Ice AGA Gas AB block form
Isopentane (2-methylbutane) Sigma-Aldrich 277258 CAS: 78-78-4
Cyrostat embedding solution Sakura Finetek Tissue Tek 4583
Cryostat Microm International Microm Model HM 500M
Slides Thermo Fisher Scientific, Inc. Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ
Cover glasses Borosilicate glass VWR international 16004-098 24 x 50 mm
Filter Paper Munktell Filter AB Quality: 1350 Article Number: 242 001 430 x 430 mm
3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) Sigma-Aldrich Sigma Liquid Substrate System, D7304
Cytochrome c (Type III, from equine heart) Sigma-Aldrich C2506 CAS: 9007-43-6
Bovine catalase (from liver) Sigma-Aldrich C9322 CAS: 9001-05-2
Nitroblue tetrazolium (NBT) Sigma-Aldrich N6876 CAS: 298-83-9
Sodium succinate Sigma-Aldrich S2378 CAS: 6106-21-4
Phenazine methosulfate (PMS) Sigma-Aldrich P9625 CAS: 299-11-6 PMS is light sensitive. Shield from light.
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032 CAS: 26628-22-8
Xylene VWR international EM-XX0060-4
Entellan VWR international 100503-870
Malonate (Malonic acid) Sigma-Aldrich M1296 CAS: 141-82-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Larsson, N. G. Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging. Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).
  2. Cottrell, D. A. Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging. Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).
  3. Harman, D. The biologic clock: the mitochondria. J. Am. Geriatr. Soc. 20, 145-147 (1972).
  4. Wallace, D. C. Mitochondrial genetics - a paradigm for aging and degenerative diseases. Science. 256, 628-632 (1992).
  5. Trifunovic, A. Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase. Nature. 429, 417-423 (2004).
  6. Ameur, A. Ultra-deep sequencing of mouse mitochondrial DNA: mutational patterns and their origins. PLoS Genet. 7, e1002028-e1002028 (2011).
  7. Safdar, A. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4135-4140 (2011).
  8. DiMauro, S., Bonilla, E., Zeviani, M., Nakagawa, M., DeVivo, D. C. Mitochondrial myopathies. Ann. Neurol. 17, 521-538 (1985).
  9. Old, S. L., Johnson, M. A. Methods of microphotometric assay of succinate dehydrogenase and cytochrome c oxidase activities for use on human skeletal muscle. Histochem. J. 21, 545-555 (1989).
  10. Chaturvedi, R. K. Impaired PGC-1alpha function in muscle in Huntington's disease. Hum. Mol. Genet. 18, 3048-3065 (2009).
  11. Edgar, D. Random point mutations with major effects on protein-coding genes are the driving force behind premature aging in mtDNA mutator mice. Cell. Metab. 10, 131-138 (2009).
  12. Ross, J. M. High brain lactate is a hallmark of aging and caused by a shift in the lactate dehydrogenase A/B ratio. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20087-20092 (2010).
  13. Crugnola, V. Mitochondrial respiratory chain dysfunction in muscle from patients with amyotrophic lateral sclerosis. Arch. Neurol. 67, 849-854 (2010).
  14. Nonaka, I. Muscle pathology in cytochrome c oxidase deficiency. Acta. Neuropathol. 77, 152-160 (1988).
  15. DiMauro, S. Mitochondrial encephalomyopathies. Neurol. Clin. 8, 483-506 (1990).
  16. Bonilla, E. New morphological approaches to the study of mitochondrial encephalomyopathies. Brain. Pathol. 2, 113-119 (1992).
  17. Brierley, E. J., Johnson, M. A., Lightowlers, R. N., James, O. F., Turnbull, D. M. Role of mitochondrial DNA mutations in human aging: implications for the central nervous system and muscle. Ann. Neurol. 43, 217-223 (1998).
  18. Borthwick, G. M., Johnson, M. A., Ince, P. G., Shaw, P. J., Turnbull, D. M. Mitochondrial enzyme activity in amyotrophic lateral sclerosis: implications for the role of mitochondria in neuronal cell death. Ann. Neurol. 46, 787-790 (1999).
  19. Gellerich, F. N. Mitochondrial respiratory rates and activities of respiratory chain complexes correlate linearly with heteroplasmy of deleted mtDNA without threshold and independently of deletion size. Biochim. Biophys. Acta. 1556, 41-52 (2002).
  20. Larsson, N. G. Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice. Nat. Genet. 18, 231-236 (1998).
  21. Ekstrand, M. I. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1325-1330 (2007).
  22. Seligman, A. M., Karnovsky, M. J., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. Nondroplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB). J. Cell. Biol. 38, 1-14 (1968).
  23. Dubowitz, V., Brooke, M. Muscle Biopsy: A Modern Approach. , Saunders. (1973).
  24. Cottrell, D. A. Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age. Neurobiol. Aging. 22, 265-272 (2001).
  25. Blanco, C. E., Sieck, G. C., Edgerton, V. R. Quantitative histochemical determination of succinic dehydrogenase activity in skeletal muscle fibres. Histochem. J. 20, 230-243 (1988).
  26. Moraes, C. T., Ricci, E., Bonilla, E., DiMauro, S., Schon, E. A. The mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle. Am. J. Hum. Genet. 50, 934-949 (1992).
  27. Petruzzella, V. Extremely high levels of mutant mtDNAs co-localize with cytochrome c oxidase-negative ragged-red fibers in patients harboring a point mutation at nt 3243. Hum. Mol. Genet. 3, 449-454 (1994).
  28. Tulinius, M. H., Holme, E., Kristiansson, B., Larsson, N. G., Oldfors, A. Mitochondrial encephalomyopathies in childhood. I. Biochemical and morphologic investigations. J. Pediatr. 119, 242-250 (1991).
  29. Haas, R. H. The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease. Mol. Genet. Metab. 94, 16-37 (2008).

Tags

Клеточной биологии выпуск 57 старения мозг COX / SDH гистохимии митохондрии митохондриальная болезнь митохондриальная дисфункция мтДНК мтДНК мутации дыхательной цепи
Визуализация митохондриальной дыхательной функции использованием цитохрома<em> C</em> Оксидазы / сукцинатдегидрогеназы (ЦОГ / SDH) Дважды маркировки гистохимии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ross, J. M. Visualization of… More

Ross, J. M. Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry. J. Vis. Exp. (57), e3266, doi:10.3791/3266 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter