Visualização da função respiratória mitocondrial usando Citocromo C Desidrogenase Oxidase / Succinato (COX / SDH) Histoquímica rotulagem dupla

O objetivo geral deste procedimento é permitir a visualização direta das deficiências das enzimas respiratórias mitocondriais em seções de tecido fresco congelado. Isso é feito coletando primeiro seções de criostato do órgão de interesse. A segunda etapa do procedimento é realizar a Histoquímica de Cox, que é seguida pela Histoquímica SDH.

Finalmente, as seções de tecido são desidratadas, montadas e a tampa deslizada. Em última análise, os resultados podem mostrar a quantidade de disfunção mitocondrial através da quantidade de coloração azul celular. Hi.Today vamos falar sobre a técnica HISTOQUÍMICA de dupla marcação Cox SCH.

E embora esse método possa ser aplicado para estudar doenças mitocondriais, ele também pode fornecer informações sobre o envelhecimento e distúrbios relacionados à idade. Depois de remover o cérebro de um animal que foi sacrificado de acordo com a permissão ética, congele-o rapidamente em gelo seco. O tecido congelado pode ser mantido a 80 graus Celsius negativos, embrulhado em papel alumínio até que esteja pronto para seccionar.

Prepare o tecido para a criossecção, colocando o cérebro em um mandril de criostato e envolvendo-o com composto de incorporação. Coloque rapidamente o mandril no criostato e colete seções de 14 mícrons a menos 21 graus Celsius. Descongele as seções em lâminas usando um bloco de aquecimento e deixe as lâminas secarem em temperatura ambiente por uma hora.

Coloque as lâminas em uma câmara de coloração de lâminas com tiras de papel úmido. Como os tempos de reação são importantes neste ensaio, recomenda-se processar no máximo 10 lâminas por experimento sob uma capa química. Preparar a incubação, o meio contendo dab e citocromo C em PBS e vórtice.

Adicione rapidamente dois microgramas de CDEs bovinos ao meio e misture bem por vórtice. Para quebrar todos os grãos de CDEs que ainda trabalham sob o capô, aplique 150 a 200 microlitros de meio de incubação em cada lâmina usando a ponta da pipeta para espalhar uniformemente em todas as seções. Incube as lâminas por 40 minutos a 37 graus Celsius.

Após 40 minutos, remova o meio de incubação das lâminas. Lave as lâminas quatro vezes em PBS por 10 minutos de cada vez. Depois de lavar as lâminas, coloque-as de volta na câmara de coloração da lâmina com tiras de papel molhadas trabalhando sob uma capa química.

Prepare a solução NBT em PBS tomando cuidado para proteger o PMS do vórtice de luz, aplique rapidamente 150 a 200 microlitros da solução NBT em cada lâmina usando a ponta da pipeta para espalhar uniformemente em todas as seções. Incube as lâminas por 40 minutos a 37 graus Celsius após 40 minutos, remova o excesso de solução das lâminas. Lave as lâminas quatro vezes em PBS por 10 minutos de cada vez.

Desidratar as lâminas por dois minutos cada nas seguintes concentrações sequenciais de etanol. 70%70%95%95%e 99,5%Finalmente, aguarde 10 minutos em um passo adicional de 99,5%. Coloque as lâminas em xileno por 10 minutos, monte com LAN e aplique lamínulas.

Deixe os slides secarem durante a noite ou pelo menos uma a duas horas em uma área ventilada aqui. Seções cerebrais do tipo selvagem e envelhecimento prematuro. MT. Camundongos mutadores de DNA foram marcados sequencialmente para atividades de COX e SDH.

A atividade normal de Cox indicada pela coloração marrom-escura é observada no hipocampo de camundongos do tipo selvagem. As deficiências de Cox indicadas pela coloração azul foram reveladas no hipocampo de camundongos mutadores de DNA MT em 12 e 46 semanas. Houve uma diminuição adicional na atividade de Cox às 46 semanas de idade em camundongos com mutação M-T-D-N-A, sugerindo exacerbação generalizada da disfunção da cadeia respiratória.

Tempos de incubação inadequados de 10 e 25 minutos resultaram em redução da deposição do produto da reação da marron. Os tempos de incubação reduzidos permitiram a formação do produto final do Foran azul durante a incubação do SDH, sugerindo enganosamente a presença de células com deslizamento da cobertura de deficiências de COX. As lâminas durante a incubação da COX também resultaram em formação e deposição imprecisas do produto da reação DAB.

Embora as atividades de Cox e SDH possam ser rotuladas individualmente como mostrado aqui, a marcação sequencial provou ser vantajosa na localização de células com disfunção mitocondrial. Um exemplo de controle de especificidade para as atividades de COX e SDH no cérebro de um camundongo do tipo selvagem mostra rotulagem negativa. Portanto, não se esqueça de que trabalhar com os produtos químicos na rotulagem dupla Cox SCH é o protocolo químico é extremamente perigoso e precauções como usar trajes de laboratório adequados e uma máscara trabalhando sob o capuz químico, e também descartar o meio de incubação devem ser feitas toda vez que você realizar este ensaio.