Administração intravenosa de vetores virais adeno-associados recombinantes em modelo de rato

Resumo

Fonte: Grames, M. S., et al. Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus adeno-associado a ratos e avaliação da transdução do sistema nervoso central. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra a injeção na veia da cauda do vírus adeno-associado recombinante (AAV) em ratos. Após a injeção na veia lateral da cauda, o vírus entra na corrente sanguínea, circula pelo coração e chega ao cérebro, onde entra nos neurônios e facilita a produção de proteínas-alvo para aplicações neuroterapêuticas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Prepare o rat

1. Aumente o oxigênio para 1 L/min e ajuste a anestesia com isoflurano para 5%. Certifique-se de que a anestesia gasosa esteja fluindo para a câmara de indução, verificando todas as mangueiras de conexão e orientações da torneira.
2. Coloque o rato na câmara de indução de anestesia gasosa por cerca de 3 minutos até que o rato não responda.
3. Garanta a profundidade adequada da anestesia beliscando o dedo do pé. Não deve haver movimento no pé ou na perna após o aperto do dedo do pé.
4. Reduza a anestesia com isoflurano para 2% para manutenção e ajuste a torneira para que a anestesia flua para a máscara anestésica.
5. Coloque o nariz do rato na máscara de anestesia e ajuste o rato para que fique deitado de lado.
6. Identifique a veia lateral da cauda.
   NOTA: As veias laterais da cauda ficam aproximadamente às 10 e 2 horas, com o topo dorsal da cauda às 12 horas. Com o rato deitado de lado, a veia lateral da cauda deve estar voltada para cima.
7. Limpe a área de injeção com a almofada de preparação de álcool. O local da injeção fica a dois terços do comprimento da cauda.

2. Injete o vector

1. Segure firmemente a cauda ligeiramente acima da área de injeção com um dedo diretamente sobre a veia lateral da cauda; isso dilatará a veia.
2. Com o chanfro voltado para cima, alinhe a agulha com a veia da cauda visível na mesma direção.
3. Perfure a pele sobre a veia da cauda, tomando muito cuidado para evitar que a outra mão segure a cauda e pressione a veia da cauda.
4. Libere a pressão da veia da cauda para permitir o fluxo sanguíneo normal.
5. Mova a agulha para a veia. Para garantir que a agulha perfurou a veia da cauda, puxe ligeiramente o êmbolo para trás. Se a agulha estiver na veia, o sangue fluirá para a agulha.
   1. Reposicione a agulha conforme necessário. Em seguida, para estabilizar a agulha, mova a mão acima do local da injeção para abaixo do local da injeção e segure a extremidade da seringa contra a cauda.
6. Injete lentamente o vetor na cauda (aproximadamente 20 μL/s).
   NOTA: A veia pode perder a cor à medida que o vetor flui através dela. Os sinais de que a solução foi injetada fora da veia incluem bolhas, branqueamento da pele ou resistência ao injetar o vetor. Com a prática, a exposição extravascular pode ser minimizada.
7. Após a administração do vetor, remova a agulha do rato e pressione uma gaze contra o local da injeção para ajudar a estancar o sangramento por 30 a 60 segundos.

3. Limpeza

1. Desligue a anestesia com isoflurano e o oxigênio. Monitore o rato até que ele recupere a consciência e, em seguida, devolva-o à gaiola.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
seringa de >1-mL	BD	309626	Vem com uma agulha de 25g acoplada. Substitua por agulha de 27-30g para injeção
Agulha de 30g	BD	305106
Isoflurano	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isoflurano USP 250 mL
Máscara de anestesia	Kopf Instruments	906
Gaze	Henry Schein	100-2524	2" x 2" (5 cm x 5 cm)
Vaporizador de anestesia a gás	SurgiVet	4214322	T3 Clássico
Sequestrante de anestesia a gás	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Almofada de aquecimento	Sears	17280
70% Etanol	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 prova
70% Isopropanol	VWR	89108-160