Um Protocolo de Chelex simples para extração de DNA de Anopheles Spp.

Resumo

Uma maneira rápida e acessível para extrair qualidade parasita da malária e de DNA a partir de amostras do mosquito vetor é descrito. Capitalizando propriedades quelantes de resina Chelex, o método simples que permite a determinação do genótipo de parasitas da malária, em fases de glândulas de mosquitos mid-intestinal e de saliva, bem como a identificação molecular da Anopheles Sibling espécies por PCR.

Resumo

Países endêmicos estão adotando cada vez mais ferramentas moleculares para tipagem eficiente, identificação e vigilância contra os parasitas da malária e mosquitos vetores, como parte integrante de seus programas de controlo ^1,2,3,4,5. Para o estabelecimento sustentável dessas abordagens precisos nas operações de pesquisa para fortalecer o controle da malária e os esforços de eliminação, métodos simples e acessíveis, com o reagente parcimoniosa e requisitos de equipamentos são essenciais ^6,7,8. Aqui apresentamos uma técnica baseada Chelex simples para extrair parasita da malária e DNA vetor de espécimes coletados no campo de mosquito.

Nós identificados morfologicamente 72 Anopheles gambiae sl. Das 156 mosquitos capturados por piretro spray de capturas em quartos de dormir das famílias dentro de uma vizinhança 2.000 km ^2, do Instituto Malária em Macha. Após a dissecção de separar a cabeça eo tórax do abdômen para todas as 72 Anopheles gambiae sl. mosquitos, os dois cortes foram colocados individualmente em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e imerso em 20 ul de água desionizada. Utilizando uma ponta de pipeta estéril, cada secção de mosquito foi separadamente homogeneizados a uma suspensão uniforme na água desionizada. Do homogeneizado resultante a partir de cada secção de mosquito, 10 ul foi retida enquanto que o outro 10 ul foram transferidas para um tubo separado ml autoclavado 1.5. As alíquotas separadas foram submetidas à extração de DNA por qualquer Chelex o simplificado ou o padrão de salga a extração protocolo ^9,10. O protocolo de salting out é chamado e amplamente utilizado porque emprega altas concentrações de sal em lugar de solventes orgânicos perigosos (tais como fenol e clorofórmio) para o passo de precipitação de proteína durante a extracção de ADN ^9.

Os extractos foram utilizados como moldes para a amplificação por PCR utilizando iniciadores com alvo mitocondrial artrópode dehydroge nicotinamida-adenina-dinucleótidonase (NADH) subunidade 4 gene (ND4) para verificar a qualidade do DNA ^11, um PCR para identificação da espécie Anopheles gambiae ¹⁰ irmãos e um PCR para a digitação de infecção por Plasmodium falciparum ^12. Comparação com a qualidade do DNA (ND4) PCR mostrou sensibilidade de 93% e especificidade de 82% para a abordagem Chelex relação ao estabelecido protocolo de salting out. Os correspondentes valores de sensibilidade e especificidade foram de 100% e 78%, respectivamente, utilizando-se a identificação da espécie irmão PCR e 92% e 80%, respectivamente, para P. falciparum detecção PCR. Não houve diferenças significativas na percentagem de amostras que deram sinal amplicon com o Chelex ou a regular as trocas salinas protocolo em todas as três aplicações de PCR. A abordagem Chelex necessárias três reagentes simples e 37 min para completar, enquanto o. Salting out protocolo envolveu 10 diferentes reagentes e 2 horas e 47 minutos de tempo 'de processamento, incluindo uma etapa durante a noite Nossos resultados mostram ªno método Chelex é comparável à extração salting out existente e pode ser substituído como uma abordagem simples e sustentável de recursos limitados, onde uma cadeia de fornecimento constante de reagente é muitas vezes difícil de manter.

Protocolo

1. Dissecção Preparatória de espécimes do mosquito

1. Mosquito lugar em um corte pequeno de parafilme e montagem em microscópio de dissecção.
2. Cobrir a gota de água desionizada, para amaciar o tecido.
3. Faça uma incisão na carcaça mosquito precisamente na articulação entre o tórax eo abdômen, assim nicking fora a cabeça eo tórax da seção abdominal.
4. Transfira cada seção mosquito dissecado em um tubo de microcentrífuga limpo autoclavado de 1,5 ml prelabeled com detalhes de identificação do mosquito número e adequadamente marcados para indicar seção do corpo (por exemplo, "m" para meados de intestino seção; "ht" para a cabeça e tórax seção).
5. Descarte parafilme e limpe cuidadosamente estágio do microscópio com Kimwipe 70% de álcool-umedecidos antes de processar o mosquito seguinte.

2. Extração de DNA a partir de amostras de mosquitos

1. Pipetar 20 ul de água desionizada num tubo de amostra e a ponta da pipeta para moer o uso a secção de mosquito submerso num unsuspensão iForm.
2. Adicionar 100 ul de autoclavado 1X PBS / solução de saponina 1% a homogeneizado amostra e misturar por vórtex momentânea suave.
3. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min.
4. Centrifugar a 20.000 xg durante 2 minutos e descartar o sobrenadante.
5. Ressuspender o sedimento em 100 ul de PBS 1X.
6. Centrifugar novamente a 20000 xg durante 2 min e descartar o sobrenadante.
7. Por centrifugação suave (5 segundos), pellet ressuspender em 75 uL de água estéril desionizada e 25 uL de 20% w / v de suspensão de resina Chelex-100, em água desionizada.
8. Pierce buraco na tampa do tubo de amostra usando agulha hipodérmica estéril 23G inflamado no bico de Bunsen.
9. Suspensão fervura da amostra em banho-maria na cremalheira de flutuação (ou no bloco de aquecimento), durante 10 min.
10. Centrifugar a 20.000 xg, durante 1 min e uma solução de transferência de DNA que se seguiu no frasco de armazenamento prelabeled para utilização como molde de PCR em aplicações.

3. Plasmodium falciparum Genotipagem e Anophelesspp. Identificação Molecular

1. Adicionar 2,5 ul do extrato de DNA Chelex em 25 ul de reações de PCR para verificar a qualidade do DNA ^11, identificar a espécie Anopheles ¹⁰ e ao genótipo P. falciparum ¹² meados de intestino e infecções da glândula salivar.
2. Para maximizar o rendimento de amplicon, especialmente para P. falciparum, detecção incluem 1.5X albumina de soro bovino (BSA) no ensaio de PCR. A composição de reacção que se segue é recomendada: (2,5 ul template, primers 0,25 uM, 1,5 uM de cloreto de magnésio, 200 uM dNTPs, 1X tampão de PCR, 1,5 X e BSA 1.0u polimerase de ADN Taq, em 25 volumes uL).
3. Para verificar a qualidade do DNA em extrato, amplificar região do mitocondrial desidrogenase nicotinamida adenina dinucleotídeo artrópodes (NADH) subunidade 4 (ND4) gene (primers ND4FW [5'-GTD YAT TTA TGA TTR CCT ​​AA-3 '] e ND4RV [5' -CTT CGD CTT CCW ADW CGT TC-3 ']; esperar produto 400pb) ^11,13.
4. Para diferenciar Anopheles gambiade e sl espécies. irmãos (An. gambiae ss e Uma arabiensis. apenas), amplificar região flanqueando SNPs no espaçador intergênica (IGS) região (primers ONU [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 '], GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 '], AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3']; esperar 390bp Um produto ss gambiae, 315bp Uma arabiensis) ^10,11.
5. Para a tipagem P. falciparum antifolato polimorfismos de resistência a drogas, realizar PCR aninhada para amplificar região flanqueadora codões de aminoácidos 108, 51, 59, 16 e 164 no parasita diidrofolato redutase (DHFR), gene:
   Primers redondos primárias: M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 '] e M5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
   Secundárias primers redondos: M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 '] com F / [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
   Ou
   F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] com M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 ']).
   Também amplificar região contendo codões de aminoácidos 436, 437, 540, 581 umnd 613 no P. falciparum dihidropteroato sintetase gene (dhps):
   Primário redondo primers R2 [5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 '] com R / [5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3'];
   Secundárias primers redondas
   J: [5'-'TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3'] com K / [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 ']
   Ou
   K: [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 '] com K /,
   Ou
   L [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 '] com L / [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3'] ^12.
6. Amplicon Sujeito 4 ul de alelo-específicos digestões com enzimas de restrição, em 30 ul de reacções seguindo as instruções do fabricante, para detectar drogas antifolato associadas à resistência polimorfismos ^12.
7. Ul sujeito 5 de PCR amplicon (ou 15 ul de digestão de restrição) por pista de etídio corado com brometo de gel de agarose a 2% para electroforese (100 - 120V) e visualizar as bandas num transiluminador UV.

Resultados

Exemplos de resultados de ensaios de PCR para a qualidade do extracto mosquito DNA (Figura 1), Anopheles arabiensis identificação molecular (Figura 2) e P. falciparum de detecção (Figura 3) mostra que o método de Chelex simplificada dá resultados semelhantes ao padrão de salting out protocolo ^10, apesar de muito menos passos (Tabela 1). Com uma qualidade comparável DNA nos respectivos extractos, não é surpreendente que a taxas de positividade de amostra em relação a um. espécies crípticas gambiae, bem como as taxas de infecção do parasita não foram estatisticamente diferentes com base no teste de McNemar qui-quadrado (Figura 3).

Sensibilidade (%) foi calculada como TP / (TP + FN) * 100, onde TP denota verdadeiros positivos e falsos negativos FN indica. Especificidade (%) foi determinada como TN / (TN + FP) * 100, onde TN indica verdadeiros negativos e FP denota falsos positivos. A qualidade do ADN (ND4) PCR mostrou sensibilidade de 93% e especificidade de 82% para a abordagem Chelex em comparação com o padrão estabelecido ouro salting out protocolo como. Os correspondentes valores de sensibilidade e especificidade foram de 100% e 78%, respectivamente, utilizando-se a identificação da espécie irmão PCR e 92% e 80%, respectivamente, para P. falciparum detecção PCR.

A adição de BSA para misturas de reacção resultou em um aumento geral de positivos de PCR (Figura 3), devido ao alívio da PCR inibidores ^14, tanto para o Chelex simplificada e regular salting out protocolo. No entanto, este aumento não foi estatisticamente significativa, exceto para a qualidade do DNA (ND4 PCR) em extratos Chelex (p = 0,039). Específica de alelo de digestão com enzimas de restrição em P. falciparum DHFR (ou outro gene alvo) amplicon permite a genotipagem de infecções da glândula do intestino médio e salivares malária para os alelos de resistência da droga (Figura 4, os dados de glândulas salivares não mostrado).

Procedimento simples Chelex		Padrão Salga fora Procedimento
Passos	Reagentes	Passos	Reagentes
Adicionar espécime a 1,5 ml tubo de microcentrífuga e homogeneizar em 100 ul de PBS 1X / Saponina solução a 1% (2 min). Deixar a temperatura ambiente durante 20 min. Centrifugação a 20000 xg durante 2 min e descartar o sobrenadante. Adicionar 100 ul de PBS 1X e misture delicadamente por momentaneamente vórtex (3 seg.) Centrifugação a 20000 xg durante 2 min e descartar o sobrenadante. Adicionar 25 ul de 20% de Chelex w / v em água desionizada e 75 uL de água estéril desionizada. Pierce buraco na tampa do tubo de amostra usando quente, agulha hipodérmica estéril 23G e conteúdo do tubo ferva por 10 min. Girar o tubo de microcentrífuga de 20000 xg durante 1 min. Transferir o sobrenadante para frasco prelabeled estéril e solução de ADN armazenar a -20 ° C até à sua utilização (2,5 ul de reacção de PCR de 25 uL).	PBS Saponina Chelex-100 esferas	Adicionar espécime a 1,5 ml tubo de microcentrífuga e homogeneizar em 100 ul de tampão * Bender com DEPC a 1% (2 min). Incubar a 65 ° C durante 1 h. Adicionar 15 ul de acetato de potássio a frio 8 M. Misturar suavemente e incubar em gelo durante 45 min. Centrifugue a amostra em tubos de microcentrífuga a 20000 xg durante 10 min e de transferência de sobrenadante para um tubo novo ml 1.5. Adicionar 250 ul de etanol a 100% e misturar bem invertendo o tubo. Incubar amostra à temperatura ambiente durante 5 min. Girar as amostras a 20.000 xg durante 15 min. Aspirar e descartar o sobrenadante, deixando o sedimento secar completamente no tubo (30 min). Ressuspender o granulado em 20 ul de 0,1 X SSC + RNAse (10 ug / ml) durante a noite a 4 ° C. Adicionar 80 ul de água tratada com DEPC e armazenar a -20 ° C até à sua utilização.	Dietilpirocarbonato (DEPC) * Bender Buffer: 0,1 M de NaCl Sacarose 0,2 M 0,1 M de Tris-HCL 0,05 M de EDTA, pH 9,1 SDS a 0,5% em água DEPC 8 de acetato de potássio M Etanol 0,1 X salina tampão de citrato de sódio (SSC) RNAse (10 ug / ml)
Tempo total: 37 min		Tempo total: 2 horas 47 min, mais durante a noite

Tabela 1. Passo a passo de comparação dos reagentes e requisitos de tempo para a Chelex protocolo simples e ficarard salting out método de extração de DNA a partir de amostras de mosquitos.

Figura 1. ND4 mitocondrial comparação PCR de DNA de qualidade simplificada Chelex "C" e padrão salting out "M" extractos de amostras de campo Anopheles arabiensis. NC, controlo negativo; M1 e C1, C2 e M2, M3 e C3, e C4 e M4 são emparelhados salting out e extractos a partir de uma mesma Chelex. espécimes do mosquito arabiensis. L, 100 bp ADN.

Figura 2 molecular de PCR para identificação arabiensis Anopheles C1 e M1, M2 e C2, C3 e M3, M4 e C4 denotam amplicon respectiva de salting out "M" e simplificado Chelex "C" extratos de DNA para amostras de mosquitos mesmos;.. AR, Anopheles arabiensiscontrole positivo; L, 100 bp ADN.

Figura 3. Detecção de positivos sobre Chelex e salga fora extratos de DNA de amostras de campo do mosquito, com ensaios de PCR para a identificação molecular de Anopheles arabiensis (AR) ^10, artrópode gene NADH desidrogenase 4 (ND4) teste de DNA de qualidade ¹¹ e P resistência antifolato droga . falciparum DHFR genotipagem ¹² (F-M4). Os resultados apresentados para os testes realizados com ou sem BSA na mistura de reacção. O teste de McNemar de qui-quadrado foi usado para determinar se as diferenças entre cento dos PCRs positivas de DNA extraído a partir da Chelex simplificada e o padrão de salting out protocolos foram estatisticamente significativas.

P. falciparum em mosquitos (meados de intestino dados mostrados) para os alelos de resistência a drogas. BstN I em digestão amplicon flanqueando codão 108 do P. falciparum gene DHFR ¹² mostra os mutantes resistentes cicloguanilo S108T em amostras de mosquitos (M1-M5; mid-intestinal dados apresentados). U, 522 pb digerido amplicon; FCR3, padrão de laboratório P. falciparum clone controle positivo levando S108T; K1, P. falciparum laboratório padrão de controle clone contábil negativo cicloguanilo sensível S108N, L, 100 bp ADN.

Discussão

O método aqui apresentado Chelex simplificado permite que a extracção de qualidade Anopheles spp e P. falciparum a partir de amostras de DNA de mosquitos passíveis de diversas aplicações de PCR. Esta técnica pode ser utilizada para a identificação molecular de mosquitos vectores da malária e de vigilância de fármaco-resistente P. alelos falciparum em mosquitos para os programas nacionais de controlo da malária. As vantagens da técnica Chelex simplificado incluem a simplicidade, os reagentes menos e, portanto, o custo, a segurança e o tempo de processamento mais curto (37 min) do que os protocolos standard, tais como o método de salting out ¹⁰ (2 h 47 min e uma etapa durante a noite, a Tabela 1). As vantagens e os requisitos acima mencionados reagentes mínimos (3 reagentes) em relação ao protocolo padrão atual (10 reagentes, Tabela 1) ^11,15, fazer o protocolo simplificado Chelex particularmente amigável para os laboratórios de países endêmicos, onde reagentes uma constantecadeia de fornecimento é muitas vezes difícil de manter. Uma limitação deste método é que, como o protocolo padrão, foi também sujeito a inibidores de PCR conhecidos para ocorrer no tegumento mosquito ^16. No entanto, este é prontamente aliviada pela inclusão de BSA nos ensaios. BSA também tem sido empregada com sucesso como um realçador contra os inibidores da amplificação em outras aplicações de PCR ^17,18.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Chelex-100, 50-100 mesh seca	BioRad	# 143-2832
Saponina	SIGMA	142-7425
BSA	New England Biolabs	B9001S