GENPLAT: uma plataforma automatizada para Discovery Biomassa Enzima e Otimização Cocktail

Resumo

GENPLAT (Enzyme GLBRC Platform) é uma plataforma automatizada para a descoberta e otimização de coquetéis enzimáticos para a degradação da biomassa. Ele pode ser adaptado para matérias-primas múltiplas e misturas de enzimas contendo vários componentes.

Resumo

O alto custo das enzimas para a desagregação da biomassa é um grande entrave para a conversão econômica de matérias-primas lignocelulósicas em combustíveis líquidos para transporte, como o etanol. Desenvolvemos uma plataforma integrada de alto rendimento, denominada GENPLAT, para a descoberta e desenvolvimento de enzimas e coquetéis enzimáticos inovadores para a liberação de açúcares a partir de diversas combinações de biomassa e pré-tratamentos. O GENPLAT compreende quatro elementos: enzimas puras individuais, planejamento estatístico de experimentos, pipetagem robótica de suspensões de biomassa e enzimas, e determinação automatizada colorimétrica de Glc e Xyl liberados. As enzimas individuais são produzidas por expressão em Pichia pastoris ou Trichoderma reesei, ou por purificação cromatográfica a partir de coquetéis comerciais ou extratos de microrganismos novos. Modelos de mistura simplex reticulados (fatoriais fracionários) são elaborados utilizando software estatístico comercial de Planejamento de Experimentos. Misturas enzimáticas de alta complexidade são montadas por meio de pipetagem robótica em formato de placas de 96 poços. A quantificação de Glc e Xyl liberados é automatizada utilizando ensaios colorimétricos acoplados a enzimas. Misturas enzimáticas otimizadas contendo até 16 componentes foram testadas em diversas combinações de matérias-primas e pré-tratamentos.

O GENPLAT é adaptável a misturas de enzimas puras, misturas de produtos comerciais (por exemplo, Accellerase 1000 e Novozyme 188), extratos de microrganismos novos ou combinações desses. Para preparar e testar misturas de ˜10 enzimas puras requerem menos de 100 μg de cada proteína e menos de 100 reações no total, quando operado com uma carga total final de 15 mg de proteína/g de glicana. Utilizamos enzimas de várias fontes. As enzimas podem ser purificadas de fontes naturais, como culturas fúngicas (por exemplo, Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, e Galerina marginata), ou podem ser produzidos pela expressão dos genes codificadores (obtidos a partir do número crescente de sequências genômicas microbianas) em hospedeiros como E. coli, Pichia pastoris, ou um fungo filamentoso, como T. reesei. As proteínas também podem ser purificadas a partir de coquetéis enzimáticos comerciais (por exemplo, Multifect Xylanase, Novozyme 188). Um número crescente de enzimas puras, incluindo glicosil hidrolases, esterases ativas sobre a parede celular, proteases e liases, está disponível no mercado, por exemplo, da Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com) e PROZOMIX (www.prozomix.com).

O software Design-Expert (Stat-Ease, Inc.) é utilizado para criar delineamentos simplex-lattice e para analisar as respostas (neste caso, a liberação de Glc e Xyl). As misturas contêm de 4 a 20 componentes, cujas proporções podem variar entre 0 e 100%. Os pontos do ensaio geralmente incluem os vértices extremos com um número suficiente de pontos intermediários para gerar um modelo válido. Na terminologia de planejamento experimental, a maioria dos nossos estudos corresponde a experimentos do tipo "mistura", o que significa que a soma de todos os componentes resulta em uma carga total fixa de proteína (expressa como mg/g de glucana). O número de misturas no simplex-lattice depende tanto do número de componentes na mistura quanto do grau do polinômio (quadrático ou cúbico). Por exemplo, um experimento com seis componentes envolverá 63 reações separadas com um modelo cúbico especial aumentado, capaz de detectar interações de três fatores, enquanto apenas 23 reações individuais são necessárias com um modelo quadrático aumentado. Para misturas contendo mais de oito componentes, um delineamento experimental quadrático é mais prático, e, em nossa experiência, tais modelos geralmente são estatisticamente válidos.

Todos os carregamentos enzimáticos são expressos como uma porcentagem do carregamento total final (que, em nossos experimentos, é tipicamente de 15 mg de proteína/g de glicana). Para enzimas "principais", o limite inferior é definido em 5%. Esse limite foi derivado de nossa experiência, na qual os rendimentos de Glc e/ou Xyl foram muito baixos quando qualquer enzima principal estava presente em 0%. Modelos inadequados resultam de um número excessivo de amostras que apresentam rendimentos muito baixos de Glc ou Xyl. O estabelecimento de um limite inferior determina, por sua vez, um limite superior. Ou seja, em um experimento com seis componentes, se o limite inferior para cada componente individual for definido em 5%, então o limite superior para cada componente individual será de 75%. Os limites inferiores para todas as demais enzimas consideradas "acessórias" são definidos em 0%. As designações "principal" e "acessória" são algo arbitrárias e variarão conforme o substrato, mas em nossos estudos as enzimas principais para a liberação de Glc a partir de palha de milho compreendem as seguintes enzimas de T. reesei: CBH1 (também conhecida como Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1 (Cel7B), BG (β-glicosidase), EX3 (endo-β1,4-xilanase, GH10) e BX (β-xilosidase).

Protocolo

1. Produção da enzima

1. Produzir proteínas em Pichia pastoris por clonagem dos genes correspondentes em vetores pPICZ ou pPICZα e transformação em P. pastoris. Cultivar células em 300 ml em lotes perplexo de 500 ml frascos com a indução de metanol cada hr 24 (Banerjee et al., 2010a).
2. Concentrar e dessalinizar os filtrados de cultura por filtração de fluxo tangencial.
3. Armazenar as enzimas em pequenas alíquotas em glicerol 20% a -80 ° C. A faixa de concentração é 1-10 mg / ml.

2. Design da Experiência

1. Introduza o número de enzimas a serem testados, o seu superior e proporções mais baixas (por exemplo, uma menor proporção de 5% para enzimas core), e do tipo de projeto experimental (por exemplo, quadrática ou cúbica) para o Design-Expertsoftware.
2. Calcular a quantidade em mg de cada enzima para ser adicionado ao fazer uma carga total de 15 glucan mg / g, e depois calcular a quantidade de cada enzima em mL para adicionarcada reação.
3. Gerar planilhas do Excel especificando labware fonte, poços fonte, material de laboratório de destino, poços de destino, e os volumes de transferência para distribuição de água e enzimas de acordo com o delineamento experimental e importá-lo para o software FXP Biomek usando a função de transferência-do-arquivo.

3. A hidrólise enzimática

1. Suspender a suspensão de biomassa em 50 mM de citrato de sódio, pH 4,8, contendo 5 mg / ml de tetraciclina e 5 cicloheximida mcg / ml, no reservatório de remo.
2. Roboticamente pipeta 200 mL da suspensão em cada poço de uma placas de 96 poços profundos bem-Span reação utilizando-8 dicas 1000-Pipete com os últimos 0,5 centímetros cortada. Misture a pasta uma vez em 100 l / seg e depois aspirar o mesmo volume do reservatório paddle e dispensar para as placas.
3. Dispense as enzimas para a mesma placa usando o programa entrou no FX Beckman.
4. Selar as placas com capmats perfurável.
5. Inverter e toqueas placas diversas vezes para vencer a tensão superficial. Coloque as placas a 50 ° C por 48 h em incubadora a hibridização girando a 10 rpm.

4. Determinação de Glc e XYL

1. Centrifugar as placas de reação para 3 min a 1250 xg em uma centrífuga de caçamba móvel.
2. Transferência de 100 ml do sobrenadante para regulares placas de 96 poços usando o pod AP96 do FX Biomek.
3. Incubar as placas a 90-95 ° C por 10 min, a fim de inativar as enzimas, e, em seguida, centrifugar a 1250 xg por 30 seg.
4. Para medições Glc, transferir 12 mL do sobrenadante em regulares placas de 96 poços. Adicionar 192 mL do reagente glicose oxidase / peroxidase (GOPOD). Incubar as placas a 50 ° C por 20 min e ler as absorvâncias a 510 nm em um leitor de microplacas. Em branco é mistura de reação sem enzima.
5. Para medições XYL, transferência de 4 mL em 384 poços pratos. Adicionar os reagentes de ensaio e ler as placas a 340 nm. Em brancoé a mistura de reação sem enzima.

5. Análise de Dados

1. Converter os valores de absorbância ao seu Glc% e os rendimentos XYL baseado no Glc conhecido e conteúdo XYL da biomassa original. Importar esses percentuais como as respostas para o software de Design-Expert. Verifique o paramenters estatísticos a certeza de que os critérios para um modelo robusto são cumpridas.
2. Confirmar a previsão de melhor modelo experimental.

6. Resultados representante com GENPLAT:

(1) Criação de misturas otimizadas de proteínas individuais puro. Os resultados indicam que as enzimas são importantes, e em que proporções, e também quais as enzimas não são importantes. Algumas proteínas que são abundantes na T. reesei secretome (Nagendran et al., 2009), como CIP1 e CIP2, parecem desempenhar nenhum papel na libertação de Glc palha de milho pré-tratados pela expansão de amônia fibra (AFEX) ou alcalina hyd rogen peróxido (AHP) (Banerjee et al., 2010b). Por outro lado, algumas proteínas são inesperadamente importante. Por exemplo, endo-xilanases de famílias hydrolase glicosil 10 e 11 são ambos importantes para Glc libertação; uma xilanase não pode substituir o outro (Banerjee et al, 2010b, c).. Cel61A, uma proteína menor no T. reesei secretome, é muito importante para Glc mas não XYL lançamento. Algumas enzimas são importantes para a liberação de ambos os Glc e XYL, enquanto outras são necessárias apenas para um ou outro (Banerjee et al., 2010C).

A mistura sintética contendo 16 componentes, cada um com uma concentração de 0,94 mg / ml (ou seja, uma mistura não-otimizado), lançado 38% do Glc disponível a partir de pré-tratamento AFEX DDG. Em condições idênticas de hidrólise, uma mistura optimizada, em que as concentrações dos 16 componentes variou de 0% a 32%, liberado 52% do Glc (Fig. 2). Este experimento ilustra a utilidade da construção de misturas definidas.

_content "> Criação (2) de cocktails otimizado para pré-tratamento diferente / combinações de substrato. atual celulase preparações comerciais são" one-size-fits-all ". Na realidade, o melhor cocktail depende tanto do substrato e pré-tratamento. Um produto único como Accellerase 1000 dá rendimentos diferentes dos diferentes substratos pré-tratados da mesma forma, e do mesmo substrato exposto a diferentes pré-tratamentos (Fig. 1). Usámos GENPLAT para otimizar misturas de enzimas pré-tratamentos puro para múltiplas e matérias-primas mutiple (Banerjee et al., 2010C). Figura 2 mostra como as proporções de enzima ideal de 16 enzimas pura difere para AFEX pré-tratamento palha de milho, AHP pré-tratamento palha de milho, e AFEX pré-tratamento DDG. Apenas 11 enzimas são mostrados na Figura 2. porque o ideal proporções dos outros cinco (Cel61B, AbfB, CIP1, CIP2 e Cel12A) foram encontrados para ser 0% (Banerjee et al., 2010C).

(3) a descoberta de enzimas Novel T. reesei e A. niger cultivado em diferentes substratos. Um extrato particular impulsionou o rendimento Glc quando adicionado ao nosso conjunto central. A proteína responsável foi purificada e demonstrou ser um romance glicosil hidrolase não está presente em qualquer preparação enzimática comercial (Banerjee e Walton, resultados não publicados).

(4) A descoberta de enzimas melhor. Tendo mostrado com GENPLAT enzimas que são mais importantes para a degradação de umabiomassa particular, temos uma melhor compreensão de quais enzimas deve ser o foco para a melhoria. Melhores exemplos das enzimas crítica pode ser encontrada através de pesquisa na natureza ou obtidos por engenharia de proteínas. (Uma enzima poderia ser "melhor" do que o seu homólogo T. reesei de várias maneiras, dependendo da propriedade desejada, atividade, por exemplo, mais específicos, maior sinergia, diminuição da sensibilidade proteolítica, ou estabilidade térmica melhorada). GENPLAT fornece uma plataforma significativa para a dosagem de enzimas potencialmente melhor, porque ele utiliza um cocktail realisticamente complexas (importante porque nenhuma enzima biomassa funciona isoladamente) e um substrato realista (importante porque os resultados com celulose pura ou outros substratos artificiais não podem ser relevantes para lignocelulósicos naturais materiais).

(5) otimização da enzima comercial. Quantidades suficientemente grande de enzimas puras ainda não existem no mundo real. Até que o façam, o etanol protores deve confiar em produtos comerciais, como Accellerase 1000 e MultifectXylanase. No entanto, as misturas de enzimas comerciais geralmente têm melhor desempenho do que qualquer um indivíduo, e GENPLAT pode ser usada para projetar cocktails otimizado de várias enzimas comerciais. A Figura 3 mostra o uso de GENPLAT para otimizar uma mistura de quatro preparações de enzimas comerciais. As proporções ideais para a liberação de Glc AFEX de pré-tratamento DDG foram encontrados para ser 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pectinase, 22% Novozyme 188, e 4% Multifect xilanase (Banerjee et al., 2010C). Figura 3B mostra as diferenças no rendimento de AFEX Glc-DDG com quatro preparações enzimáticas; a mistura otimizada comerciais dá maior rendimento do que Glc Accellerase1000 sozinho, SpezymeCP sozinho, ou uma mistura de 16 componentes sintéticos. Esta experiência também indica que a mistura de 16 componentes sintéticos está faltando uma ou mais enzimas necessárias para uma ótima Glc lançamento, que estão presentes em uma ou mais das enzimas comerciais. GENPLAT pode ser-nosed para identificar tais componentes.

Figura 1. Nenhuma preparação única enzima comercial é ideal para todos os substratos e todos os pré-tratamentos. Cinco substratos e três pré-tratamentos foram comparados em condições similares de moagem (0,5 milímetros de tamanho de partículas), enzima de carga (15 mg glucana / g), e as condições de hidrólise (48 hr, 50 ° C) Digestão. A. de diferentes substratos AFEX pré-tratamento com Accellerase 1000. B. A digestão de palha de milho pré-tratados por três métodos diferentes, com Accellerase 1000 (ver Banerjee et al., 2010C).

Figura 2. Proporções Optimal de 11 enzimas para liberação de Glc AFEX de pré-tratamento palha de milho (AFEX-CS), peróxido de hidrogênio alcalino pré-tratamento palha de milho (AHP-CS), ou pré-tratamento AFEX secas destilargrãos ers "(AFEX-DDG). Os dados são do Banerjee et al. (2010C). Números ao longo do topo das barras são os rendimentos Glc como uma porcentagem do Glc total na amostra de biomassa.

Figura 3. A. O uso de GENPLAT para produzir uma mistura optimizada de quatro preparações de enzimas comerciais para liberação de Glc AFEX de pré-tratamento DDG. Multifect xilanase fez a menor contribuição (4%) e, portanto, omitidos neste diagrama ternário. Rendimentos B. Glc de AFEX-DDG com tratamentos diferentes enzimas em condições idênticas de hidrólise (15 enzima glucano mg / g, 48 h, 50 ° C) . "Four-componente comercial" tem as proporções determinadas a partir do experimento mostrado na figura. 3A.

Discussão

É amplamente reconhecido que a redução do custo das enzimas é importante para o desenvolvimento de uma indústria de etanol lignocelulósico econômica. Atualmente disponíveis coquetéis enzimáticos comerciais são misturas complexas e mal definidas de muitas proteínas (Nagendran et al., 2009), e eles são adaptados principalmente para uso em pré-tratamento ácido palha de milho. A fim de acelerar o desenvolvimento de cocktails melhor enzima, vários laboratórios têm desenvolvido high-throughput plataformas para a descoberta e caracterização de enzimas. Esforços nesta área têm incorporado um ou mais das seguintes propriedades também encontrada em GENPLAT: dispensa robótico de enzimas e suspensões de biomassa, a concepção estatística de experimento, e / ou determinação automatizada de Glc e XYL (Berlin et al, 2007; Decker et. al, 2009;. Kim et al, 1998;. King et al, 2009).. GENPLAT estende esses esforços anteriores, mais significativamente na complexidade das misturas de enzimas que podem ser analisados ​​a partir de no máximo seis componentes emos estudos mais cedo para mais de 16 no nosso mais recente trabalho (Banerjee et al., 2010C). Adicionais das principais características do GENPLAT são o uso de uma câmara de talão de mistura (reservatório de paddle) que pode manter pastas suspensas durante stover dispensação; suave mistura durante a digestão até o final de over-final da rotação, e determinação colorimétrica automatizada de Glu e XYL.

Materiais

Equipamentos e software utilizados:

1. Design-Expert software, Version 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) ( http://www.statease.com )
2. Biomek FXP laboratório de automação de estações de trabalho (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
3. Biomek FXP software, Version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
4. Reservatório de Paddle (Modelo VP-756C 1P100, V & P Scientific Inc., San Diego)
5. Placas, 96 de profundidade (1,5 ml) bem (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
6. Capmats perfurável (EUA Científico, Ocala, FL)
7. Hibridização rotativa incubadora (Modelo 5420, VWR)
8. Balançando-balde de centrifugação (Modelo 5810R, Eppendorf, Hamburgo, Alemanha)
9. Placas, Costar de 96 poços (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
10. Placas, de 384 poços (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)

Reagentes utilizados:

1. Pichia pastoris e vetores: cepa X33, e pPICZ e pPICZα (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. T. reesei e vetores: tensão QM9414 (Departamento de Agricultura dos EUA Centro Nacional de Pesquisa de Utilização Agrícola, Peoria, IL), e pCB1004-EV (Banerjee et al, 2010b).
3. Accellerase 1000 (número do lote 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY)
4. 50 mM tampão citrato de sódio, pH 4,8
5. Tetraciclina estoque: 10 mg / ml
6. Cicloheximida estoque: 10 mg / ml
7. GOPOD ensaio kit, catálogo K-glic (Megazyme, Bray, Irlanda)
8. Xilose ensaio kit, catálogo K-xilose (Megazyme, Bray, Irlanda)