Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar

Summary

Estamos descrevendo um método para submeter células aderentes a tensão de cisalhamento do fluxo laminar em um circuito de fluxo contínuo estéril. Adesão das células, a morfologia pode ser estudada através da câmara transparente, amostras obtidas do circuito para análise de metabólitos e células colhidos após a exposição de cisalhamento para futuros experimentos ou cultura.

Abstract

O objetivo geral deste método é descrever uma técnica para assunto células aderentes às condições de fluxo laminar e avaliar sua resposta ao cisalhamento de fluidos bem quantificáveis ​​sublinha ^1.

Nosso projeto de câmara de fluxo e circuito de fluxo (Fig. 1) contém uma região de visualização transparente que permite o teste de adesão celular ea imagem da morfologia das células imediatamente antes de fluxo (Fig. 11A, B), em momentos diferentes durante o fluxo (Fig. 11C) , e depois de fluxo (Fig. 11D). Estes experimentos são ilustrados com cordão umbilical humano derivados do sangue células progenitoras endoteliais (EPCs) e suínos EPCs ^2,3.

Este método é também aplicável a outros tipos de células aderentes, por exemplo, células musculares lisas (PMEs) ou fibroblastos.

A câmara e todas as partes do circuito são facilmente esterilizados com autoclavagem a vapor. Em contraste com outroscâmaras, por exemplo, câmaras de microfluídica, um grande número de células (> 1 milhão, dependendo do tamanho da célula) podem ser recuperados após o experimento de fluxo sob condições estéreis para cultura de células ou de outros experimentos, por exemplo, DNA ou extração de RNA, ou imuno-histoquímica (Fig. 11E), ou microscopia eletrônica de varredura ^5. A tensão de cisalhamento pode ser ajustado pela variação da taxa de fluxo do perfusato, a viscosidade do fluido, ou a altura ea largura do canal. Este último pode reduzir o volume de fluido ou necessidades célula, assegurando simultaneamente que unidimensional de fluxo é mantida. Não é necessário para medir a altura da câmara entre os experimentos, uma vez que a altura da câmara não depende do uso de juntas, o que aumenta a facilidade de múltiplas experiências. Além disso, o projeto de circuito facilmente permite a coleta de amostras de perfusato para análise e / ou quantificação de metabólitos secretados pelas células sob exposição ao estresse de fluidos de corte, o óxido nítrico por exemplo (Fig. 12) ⁶

Protocol

1. Isolamento de células progenitoras endoteliais

1. Antes de qualquer coleta de sangue periférico humano, submeter seu protocolo de pesquisa para o seu Conselho de Revisão Institucional (IRB), e após a sua aprovação, obter os doadores voluntários "consentimento informado (coleta de sangue periférico e isolamento EPC tinha sido aprovado pelo IRB Universidade Duke e está em total conformidade com as exigências regulatórias dos EUA relacionados com a protecção dos participantes da pesquisa humana).
2. Quando se trabalha com derivados de animais EPCs, tem o seu protocolo de pesquisa aprovado pelo seu Animal Care Institucional e Use Committee (IACUC). Todos os experimentos nosso suína havia sido aprovado pela Universidade Duke IACUC e foram conduzidos de acordo com os mais altos padrões de cuidado humano.
3. Para o isolamento de células progenitoras endoteliais, recolher 50 ml de sangue periférico através de técnica de flebotomia padrão de um doador voluntário consentido em sacos de coleta de sangue preenchido com o anticoagulante citratoe fosfato dextrose e diluir a solução 1:1 com solução de Hank sal tamponada (sem CaCl _2, MgCl _2, MgSO ₄₎ e camada em volumes iguais de Histopaque para criar camadas bem definidas.
4. Centrifugação (30 min, 740 g, configuração quebrar baixo) e recolher as células mononucleares (MNC) (buffy coat) camada. Ressuspender e lavar as multinacionais x 3 com fosfato Dulbecco Buffered Saline (DPBS) com 10% de soro fetal bovino (FBS) x 10 min, 515 g, antes do plaqueamento em dois 12-lamelas em meio de crescimento integral EPC (MCDB-131 médio, com 5 ml de 200 mM L-glutamina, 10% FBS e EGM-2 SingleQuots) a 37 ° C, 5% de CO _2.
5. Mudar lentamente média a cada 24 horas durante os primeiros 7 dias, então a cada dois dias. Colônias EPC podem ser identificados após um tempo médio de 14 dias com base na sua morfologia de paralelepípedos. Uma vez EPCs na cultura ¼ capa da área de superfície de 12 também, expandir as células e confirmar a identidade EPC com citometria de fluxo por meio de testes para a presença de marcadores de superfícieCD31 e ausência de CD14, CD45, como descrito anteriormente ^6. Outros ensaios que podem ser realizados incluem a morfologia das células e rotulagem com DII-Ac-LDL.
6. Para os experimentos aqui descritos, expanda CPE isoladas, até que estejam quase confluente em 3 T-75 frascos de cultura de células em meio de EPC em uma incubadora umidificada a 37 ° C, 5% CO _2.

2. Cálculo tensão de cisalhamento

1. Recomendamos que estes cálculos são realizados antes da fabricação da câmara e canal para ter um conhecimento aprofundado das condições que podem ser alcançados. Calcular o débito do perfusato no circuito baseado no corte desejado sublinha a ser aplicada às células de acordo com a equação ¹ 1,

onde Q é a vazão desejada, τ é o alvo souvir o estresse agindo tangencialmente sobre as células, w é a largura da câmara de fluxo, h é a altura da câmara de fluxo, e μ é a viscosidade do perfusato (média de fluxo).

2. Um valor típico de viscosidade (μ) para o meio utilizado é de 0,9 cP (0,009 g cm ^-1 s ^-1). Note-se que a viscosidade também pode ser levantada por meio de alto peso molecular dextran, se assim for desejado ^7. Um valor típico de tensão de cisalhamento alvo (τ) utilizado é de 15 dinas / cm ^2, (tensão de cisalhamento típicas arterial) ou 100 dinas / cm ^2, se supra-fisiológicas tensão de cisalhamento é desejada. Nossa câmara normalmente tem uma largura (w) de 1,9 cm e altura (h) na faixa de 166-267 mM.

3. Fabricação de câmara de fluxo

1. Cortar as placas superior e inferior do the câmara de estoque de alumínio liga 6061 retangular com dimensão superior de 7 "dimensões e inferior, de 7 x 2 x 0,25" x 2 x 0,5.
2. Recesso da placa superior na porção centro para 0,125 "de profundidade, deixando 0,950" por fim para 1,375 "de largura x 0,3125" reservatório de fluido de profundidade.
3. Broca 1 / 16 "de largura x 0,625" slots longo da parte inferior, a fim de penetrar no reservatório na entrada e saída termina.
4. No final de cada placa superior, perfurar um localizado centralmente "buraco trilhas por polegada (TPI) para polipropileno 08/01" 10/32 espigão para penetrar no reservatório de fluido. Na extremidade de entrada, criar um plug lado com 10/32 "TPI através do orifício de polipropileno 1 / 8" espigão.
5. Taper inferior do topo do fluxo de fluido para a janela de visualização de vidro em 0,518 graus de mistura adequada de líquidos.
6. Cortar uma janela de lâmina de vidro para a placa de fundo de acordo com a janela de visualização superior. Usando cimento aquário, cola uma lâmina de vidro na câmara. Deixar curar pelo menos 24 horas.Garantir que a janela de visualização é recolhida de forma que a 75 x 25 x 1 mm lâmina de vidro de microscópio vão ficar completamente na câmara.
7. Criar um recesso de um anel de vedação em torno do lado de baixo das placas superior e inferior de tal forma que eles são espaçadas por 0,02 ". Inserir a borracha O-rings.
8. 10 broca correspondência 8 / 32 "buracos TPI em câmaras superior e inferior para uso com 8 / 32" parafusos de cabeça chata.

4. Montagem do circuito de fluxo

1. Monte o circuito de fluxo de todo o primeiro, em seguida, proceder à sua esterilização.
2. Anexar um "segmento de tubo rígido para uma extremidade do amortecedor de pulso (via 1 / 8" 36 de conexão). Para a outra extremidade, anexar um segmento de "18 de tubo macio.
3. Coloque um 1 / 8 "adaptador macho luer no final dos 18" seção tubos macios, mencionado na etapa 4.2. Conecte o luer macho de 1 / 8 "adaptador luer fêmea. Coloque a luer fêmea para um novo 18" tubo de segmento flexível.
4. Perfurar três buracos em um copo de vidro cap 250 ml, a fim de encaixar tubos. EuINSERI de 1,5 segmento "de tubo flexível (como entrada de ar) em um buraco e as extremidades livres dos tubos duros e moles através dos outros dois furos na tampa na garrafa de vidro 250 ml (como reservatório) (Fig. 2). garantir que o tubo rígido atinge o fundo do reservatório (como tubo de saída do reservatório).
5. Esterilizar as peças acima em autoclave a vapor a 121 ° C por 60 min. Além disso autoclave uma câmara de fluxo completo, 3 x 2 "segmentos de tubos macios, 1 macho e 1 fêmea 1 / 8" adaptador luer, 4 x ½ "e 6 x 5 / 16" flat 8-32 parafusos de cabeça, um par de pinças , um 75 x 25 x 1 lâmina de vidro mm (ou material desejado outra superfície celular), e 2 toalhas cirúrgicas.
6. Colocar toalhas estéreis em capela de fluxo laminar. Coloque o circuito de fluxo, câmara de fluxo, 4 x 4 vias torneiras, 1 x torneira de 1 via, e todas as partes esterilizados a partir do passo 4,5 para este campo estéril.
7. Agora use luvas estéreis para conectar dois de 4 vias torneiras. Tampas lugar nas portas de amostra aberto.
Separar os adaptadores macho e fêmea luer anexando os dois segmentos tubulação macia do circuito de fluxo e inserir as torneiras ligadas (Fig. 3).
8. Conecte o tubo macio inserido no reservatório a uma seringa de 30 ml e remover o pistão da seringa. Encha a garrafa com 125 ml de EPC médio (Fig. 4).
9. Colocar um filtro de seringa estéril nas aberturas de ar (Fig. 4).
10. Mova o circuito de fluxo em uma incubadora umidificada a 37 ° C, 5% CO _2.
11. Prenda o tubo rígido na cabeça da bomba rolo indicado para uso com este tipo de tubo (Fig. 5). Garantir que o tubo não se sobrepõe com as faixas rolo bomba de montagem. Mark o tubo onde ele sai da cabeça da bomba em ambos os lados com uma caneta de marcação.
12. Assegurar que todas as torneiras estão fechadas para os portos da amostra e aberto ao longo do circuito de fluxo. Ligar a bomba. Verificar a direção do fluxo. O perfusato deve mover from o reservatório de vidro através do tubo rígido para o amortecedor de pulso.

5. EPC fluorescentes rotulagem

1. Enquanto o fluxo aquece circuito para 37 ° C, preparar as células para semeadura para o slide. Note-se que a rotulagem fluorescente é necessária se as células estão a ser visualizadas em materiais opacos, por exemplo, titânio (Ti).
2. Criar uma solução estoque 1 mM de Cell Rastreador de Orange (CTO), diluindo 50 mg CTO pó com 90 mL de dimetil sulfóxido (DMSO). Certifique-se de escudo esta mistura de exposição à luz (desligar a luz, enquanto trabalha com capela de fluxo).
3. Criar uma solução de 2 mM de trabalho do CTO diluindo 36 mL de solução estoque CTO em 18 ml de soro livre de médio MCDB-131.
4. Enxágüe EPCs em 3 perto confluentes T-75 frascos de cultura de células com 10 ml DPBS (sem Ca ou Mg).
5. Adicionar 6 ml da solução de 2 mM CTO de trabalho para cada frasco. Incubar por 15 min a 37 ° C. Lave cada frasco x 2 com 10 ml DPBS (sem Ca ou Mg).
7. Lavar por centrifugação x 5 min a 600g e ressuspender em 5 ml de meio de EPC.

6. Semeadura de células da lâmina antes de fluxo de montagem de câmara

1. Um slide feita de vidro, titânio, ou outro material pode ser usado, ea superfície da lâmina pode ser modificado por spin coating com polímero ou adicionando uma camada de metal. Coloque o slide em um navio cultura estéril retangular quatro câmaras célula (ou use tecidos frasco deslize cultura se a superfície de poliestireno é desejado). Contagem de células e de sementes de 1,5 x 10 ⁶ células para o slide em 5 ml de meio de EPC x 6 hr se uma camada de células confluentes é desejado no início do fluxo (Fig. 11A).
2. A fim de testar célula se espalhando e adesão sob tensão de cisalhamento de fluidos, permitir 3 x 10 ⁶ células de aderir por apenas 15 min antes do início do fluxo (semeadura-rápido) (

7. Assembléia câmara de fluxo

1. Usando luvas estéreis, conecte um 2 "segmento de tubo macio para um 1 / 8" adaptador luer fêmea. Conectar outro 2 "tubo de segmento macio para um 1 / 8" adaptador macho luer.
2. Anexar a 2 "tubagem flexível com adaptador luer fêmea para a porta de entrada. Coloque a 2" tubo macio com luer macho para a porta de saída. Anexar 4 vias torneiras para ambos os adaptadores luer. Conectar os restantes 2 "pedaço tubulação macia ao conector de porta lateral saindo da armadilha da bolha e anexar uma torneira de 1 via (Fig. 6).
3. Usando uma pinça estéril, retire a lâmina de células-semeada a partir do navio de cultura de células (ou se estiver usando um frasco de slides, retirar o balão em slide) e colocá-lo no recesso da placa de fundo da câmara de fluxo. Certifique-se que o slide é colocado com o lado de células-semeado para cima.
4. Pipetar 10 ml de meio de EPC quente para o slide. Permitir que o meio para cobrir o slide e câmara de fluxo, but não derrame o meio sobre o O-ring na placa de fundo.
5. Coloque a placa de topo da câmara de fluxo para a placa de fundo, alinhando os orifícios dos parafusos. Tome cuidado para não introduzir bolhas de ar na câmara durante esta etapa, mantendo as duas placas paralelas.
6. Placas de parafuso em conjunto (um automático velocidades funciona com bateria e chave de fenda até este processo).
7. Remover bolhas de ar do borbulhador entrada abrindo a torneira de 1 via conectado à porta de entrada armadilha do lado da bolha e lave delicadamente o tubo de fluxo com EPC médio usando uma seringa de 10 ml. Em seguida, fechar esta torneira e tampá-lo (Fig. 7).
8. Agora remover bolhas de ar do canal de câmara, abrindo a porta de saída de 4-way torneira e delicadamente rubor médio EPC através da câmara de fluxo, novamente usando uma seringa de 10 ml. Se grandes bolhas permanecem, levantar o final saída da câmara para um ângulo de 45 ° (Fig. 8).
9. Cap todas as conexões de 4 vias torneira e fechar-los. Mover a câmara de fluxo na incubadora com o circuito de fluxo montado (Fig. 9).
10. Pausar a bomba de circuito de fluxo. Fechar as torneiras circuito de fluxo na direção do fluxo para evitar fugas e manter o interior da câmara estéril. Transportar a câmara de fluxo a partir da capela de fluxo para o circuito de fluxo. Ligue a câmara de fluxo para o circuito de fluxo. Abra as torneiras na direção do fluxo. Retomar a bomba de fluxo. Garantir que o perfusato fluxos na direção correta. Ajustar o fluxo para a tensão de cisalhamento desejado.
11. Durante o experimento de fluxo, a câmara de fluxo pode ser removida do circuito para a imagem das células através de luz ou de microscopia fluorescente. , A fim de fazê-lo, desligue a câmara de fluxo do circuito de fluxo nas conexões torneira-torneira. Para manter a esterilidade da câmara, fechar as torneiras de fluxo de circuito e torneiras câmara de fluxo na direção de fluxo e cap todas as torneiras antes de retirar o circuito de fluxoda incubadora (Fig. 9).

8. Perfusato coleta de amostras

1. Para a coleta de amostras fácil perfusato para análise, (síntese de óxido nítrico, por exemplo), primeira pausa da bomba.
2. Fechar a torneira localizada mais próxima do amortecedor de pulso. Remova a tampa protetora e inserir uma seringa pequena dimensão, por exemplo, seringas de 3 ml, na porta da amostra. Mantenha a tampa e garantir que não irá tornar-se contaminados, colocando-o de cabeça para baixo.
3. Fechar a torneira na direção da câmara de fluxo, mantendo a porta das amostras e do circuito na direção do amortecedor de pulso aberto.
4. Desenhe quantidade desejada de amostra, por exemplo mL 150, do circuito. Fechar a torneira para a porta das amostras antes de retirar a seringa. Conservar a amostra do perfusato em um frasco rotulado e congelar a - 80 ° C (para determinação de óxido nítrico em um ponto mais tarde).
5. Recap da porta amostra e garantir que todas as torneiras são abertas antes do início de fluxo.

9. Resultados representativos

Utilizando nosso método semente-rápida, humana derivados do sangue células progenitoras endoteliais pode ser semeado em lâminas de titânio por 15 minutos e aderir sob fisiológicas (arterial) forças de cisalhamento de 15 dinas / cm ^2.

Conforme mostrado na Figura 10, EPCs espalhar sob a influência do fluxo de 210 ± 11,4 mM ^2, imediatamente após a semeadura, para 657 ± 39,1 mM ² após três horas, e para 1.152 ± 55,3 mM ² após 24 horas de tensão de cisalhamento de fluidos, de 15 de dinas / cm ² (diferença entre os grupos é estatisticamente significativa com p <0,0001, 1-way ANOVA). Paralelamente ao aumento da área da célula, que pode ser trabalhada através da câmara transparente, com microscópio de luz ou fluorescente, o arredondamento calculado de acordo com a equação 2 ⁶

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diminuiu de 878 x 10 ^-3 ± 5,9 x 10 ^-3, imediatamente após a semeadura, a 671 x 10 ^-3 ± 19,2 x 10 ^-3 depois de 3 horas, e para 526 x 10 ^-3 ± 19,2 x 10 ^-3 após 48 horas da mesma exposição ao estresse fluido de cisalhamento (diferença entre os grupos é novamente estatisticamente significativa com p <0,0001, 1-way ANOVA).

Figura 11D mostra que EPCs alinhar e orientar no sentido do fluxo após 48 horas de tensão de cisalhamento do fluido em 15 dinas / cm ^2, em comparação com sua orientação aleatória após um período de semeadura estática de 6 horas, mostrada na Figura 11A.

Nosso método permite também a obtenção de amostras do perfusato em pontos de tempo predeterminado para a análise e / ou quantificação de metabólitos de células secretadas. Como um exemplo representativo que retratam a produçãoção de nitrito (NO ₂ -) durante um experimento de fluxo de 48 horas com EPCs suína na Figura 12. Nós medido diretamente este produto primário da oxidação do óxido nítrico (NO) como um marcador de NO em amostras coletadas médio do circuito de fluxo nos pontos de tempo diferente para ser 12,0 nmol menos 6 horas, 13,1 nmol menos 12 horas, 16,3 nmol menos 24 horas, e 24,6 nmol após 48 horas de 1 x 10 ⁶ células de 15 dinas / cm ^{2 6.}

Figura 1. Esquemática mostrando uma visão geral do conjunto de circuitos de fluxo e experiência de fluxo. (A) de montagem de circuitos de fluxo sem a câmara de fluxo. Incluem-se aqui do reservatório, amortecedor de pulsações, tubos rígidos, tubos macios, 4-way torneiras e conectado adaptadores luer, bem como filtro de ar. (B) Ligação da câmara de fluxo através do segmento de tubo rígido para a cabeça da bomba de fluxo. (C) Em serção do slide EPC-semeado na placa de fundo da câmara de fluxo (D). Completa montagem do circuito de fluxo com a câmara de fluxo.

Figura 2. Circuito de fluxo completamente montada para esterilização.

Figura 3. Circuito de fluxo montado após a esterilização com torneiras incluídos.

Figura 4. Enchimento do reservatório de vidro com 125 ml de meio de EPC.

Figura circuito 5. Fluxo fixada na cabeça da bomba de fluxo antes da inserção câmara de fluxo.

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Figura 6. Conjunto da placa Top de câmara.

Figura 7. Flushing o borbulhador com média EPC para remover as bolhas de um lado entrada da câmara.

Figura 8. Flushing a câmara com o meio EPC para remover as bolhas do slide e do lado de saída da câmara.

Figura 9. Completamente montado circuito de fluxo com câmara de fluxo inserida durante um experimento de fluxo.

Figura 10. Área de EPC (em mM ²⁾ aumenta ao longo do tempo da experiência de fluxo.

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Figura 11. (A) imagem de microscópio de luz HUCB EPCs semeados em uma lâmina de vidro revestido fibronectina x 6 horas antes de fluxo com ampliação de 100 x. (B) HUCB EPCs rotulados com CTO e quick-semeada em uma corrediça de Ti x 15 min antes de fluxo, visualizados por microscopia fluorescente com ampliação de 100 x. (C) O slide Ti mesmo com EPCs HUCB como em (B), após três horas de fluxo a 100 dinas / cm ² e fotografado pela câmara transparente com ampliação de 100 x. Observe a orientação disseminação de células, mas ainda aleatória após 3 horas de fluxo. (D) O slide Ti mesmo, agora depois de 48 horas de exposição do fluxo com ampliação de 100 x. EPCs são rotulados com CTO e núcleos de células são coradas com corante Hoechst (azul) depois de fluxo. Observe o alinhamento das células na direção do fluxo. (E) EPCs Porcino para comparação em Ti após 48 horas de fluxo e 15 dinas / cm

Gráfico Figura 12. Retrata a produção de suínos de EPCs durante 48 horas do fluxo. Um produto da oxidação primária de NO, nitrito (NO ₂ -), foi medido como um marcador de NO a partir de amostras coletadas em pontos de média de tempo diferentes durante o fluxo.

Figura 13. A câmara de fluxo é feito de alumínio liga 6061 ações retangular, com a seção superior (A) sendo 0,5 "x 2" x 7 "ea seção inferior (B) 0,25" x 2 "x 7" em dimensão. O topo éaplainada em sua superfície de contato de baixo-ring para 0,45 ", a fim de garantir a planicidade de vedação. A parte superior é rebaixada em sua porção centro para 0.125", o que deixa 0,95 "fim por 0,3125 para um" x 1,375 reservatório "do fluido. A reservatório seção superior é rosqueada 3/8-24 TPI e 0,25 "de profundidade para receber plugs rosca de aço inoxidável. Slots medindo 1 / 16 "x 0,625" foram usinados para o inferior, que penetrar no reservatório. A ficha de entrada do lado tem um 10/32 "buraco através de um polipropileno 08/01" espigão para anexar a uma torneira. Cada unidade tem um final localizado centralmente threaded 10/32 TPI por 0,25 "porção profunda para um polipropileno 08/01" espigão no 0.45 "x 2" end. As extremidades usar um 0,07 "buraco do fundo de tópicos por meio de penetrar no reservatório. A parte inferior da seção superior tem uma área de 0,6875 cônico" de largura, 0,518 graus do centro de um slot de LH para uma distância de 1,460 ". Este taper misturas para uma área plana 0,6875 "de largura x 0,0118" profunda e 0,590 "a partir do final do glass recesso (ou outra superfície, slide de titânio, por exemplo). Este apartamento tem de estar alinhada com o vidro (ou outra superfície, por exemplo, slides de titânio) uma vez que o slide é instalado. A vela e plana são polidos. A superfície da lâmina é 0,0118 "recesso a partir da superfície inferior. 0,0118 O" recesso continua o slot reservatório na extremidade RH. Um O-ring está embutido inteiramente em torno de slots e lâmina, deixando 0.020 "da superfície original entre o groove O-ring e slide. A parte superior e unidades de fundo são perfurados por dez buracos. A parte superior tem buracos de apuramento para 8 / 32 TPI countersunk flat parafusos de cabeça. A seção inferior tem buracos colocado correspondência dos orifícios superior e são enfiados 8 / 32 TPI. A unidade tem uma base de vidro transparente lavar janela corrediça rebaixada com sua superfície situada sobre a lâmina de vidro na superfície celular (ou slide de titânio). A unidade tem uma ranhura O-ring, que engloba ranhuras na unidade superior com largura de sair 0.04 "da superfície original entre a lâmina inferior e sulco-ring interior. O O-rings são vermelhos silicone AS568A, Dash Número 044 para a parte superior e 046 para a seção inferior.

Discussion

O nosso circuito de fluxo e câmara de fluxo nos permitem assunto células aderentes, EPCs por exemplo, para tensões de cisalhamento definida fluido. Desde o compartimento superior e inferior são de adesão, transparente e morfologia celular pode ser avaliado tanto em tempo real, através da câmara em si, ou depois de uma experiência de fluxo e desmontagem da câmara de fluxo. Nesse ponto, as células podem ser colhidas em condições estéreis e ou re-banhado, ou usado para coletar seu DNA ou RNA, etc, para posterior análise.

Para conseguir um fluxo laminar, o desenho da câmara deve ser tal que várias condições sejam cumpridas.

Primeiro, o fluxo deve ser laminar, que pode ser verificado através do cálculo o número de Reynolds (Re), que é a razão entre forças inerciais às forças viscosas. (Se as forças viscosas predominam, Re é pequeno eo fluxo é laminar ou 'plenamente desenvolvido' - geralmente para Re <2300.Se as forças de inércia predominam, o fluxo se torna mais e mais aleatória até que seja turbulento, como é o caso para Re> 4000). Podemos calcular Re acordo com a equação 3 ^8,

Onde ρ é a densidade do fluido, Q é a vazão, μ é a viscosidade, w e h são a largura ea altura da câmara, respectivamente, e D _h é o diâmetro hidráulico, definido de acordo com a equação 4 ^8,

O número de Reynolds do nosso fluxo de câmaras de três, com alturas que variam de 166-267 M, faixa 13,9-34,6 a taxas de fluxo de calculated para obter uma tensão de cisalhamento de 15 dinas / cm ^2. Em taxas de fluxo calculado para uma tensão de cisalhamento de 100 dinas / cm ^2, o número de Reynolds das câmaras variou de 90,4-234. Todos estes números são muito mais baixos Reynolds de 2300 e atender o critério de fluxo laminar.

Segundo, para o campo de velocidade e tensão de cisalhamento para ser independente da distância ao longo do canal de fluxo (ou seja, totalmente desenvolvido), a distância entre a entrada de líquido para o slide deve ser maior que o comprimento de entrada, _e L. Isto pode ser satisfeita por meio do cálculo do comprimento de entrada, conforme a equação 5 ^9.

Para os valores listados acima, o comprimento de entrada varia de 0,01 a 0,25 centímetros.

Terceiro, a fim de garantir que a velocidade ea tensão de cisalhamento na direção laterais não variamsignificativamente do valor de fluxo unidimensional canal (Δ Ph / 2L), a relação h / w deve ser muito menor que 1. Para a tensão média de cisalhamento de parede em condições bidimensionais fluxo a ser de 95% da tensão de cisalhamento parede sob unidimensional de fluxo, h / w deve ser igual a 0,10, e para a tensão de cisalhamento de parede em condições bidimensionais de fluxo para ser 97,5% da tensão de cisalhamento parede sob unidimensional de fluxo, h / w deve ser igual a 0,05. Com as dimensões da nossa câmara de fluxo projetado 1,7 centímetros de largura e 166-267 M de altura, estes critérios estão preenchidos.

A pressão vai variar apenas na direção do fluxo, se não houver gradientes de pressão lateral na entrada. Isto pode ser avaliada utilizando corantes ou partículas no caminho de fluxo. Além disso, para experimentos de fluxo contínuo, um amortecedor de pulso é inserido no circuito de fluxo. O amortecedor de pulso tira a maior parte do pulsatility causada pela bomba de roletes no circuito, e nos permite a assunção aproximado de fluxo constante. De nota, o amortecedor de pulso utilizada deve ser compatível com a bomba e tubos utilizados no circuito, de modo que ele pode efetivamente eliminar pulsações no fluxo de saída para as freqüências específicas da bomba de rolete. Em nossa demonstração do Masterflex L / S amortecedor de pulsações atinge fluxo laminar, quando utilizado na linha de descarga com qualquer bomba série Masterflex L / S (0-600 RPMs) e I / P tubo 26. Para o fluxo pulsátil, uma bomba programável pode ser usado para gerar formas de onda diferentes.

Para o fluxo pulsátil, uma bomba programável pode ser usado para gerar formas de onda diferentes.

Além disso, o circuito é projetado de tal forma que as amostras de perfusato pode ser facilmente coletadas em momentos diferentes sem o risco de contaminação das células ou médio fluxo. No nosso exemplo, a concentração de NO ₂ - foi medido por quimioluminescência comum Ionics / Sievers Analyzer óxido nítrico (NOA 280, Sievers Instruments, Boulder, CO), como descrito anteriormente ^10. O redutor usado para análise de nitrito foi de iodeto de potássio em ácido acético (14,5 M de ácido acético e 0,05 M KI), que tem o potencial de redução para converter o nitrito a NO, mas é insuficiente para reduzir qualquer óxidos de nitrogênio superiores tais como o nitrato e, portanto, é relativamente específico para nitrito. O nitrito total produzido foi calculado como o produto da concentração produzida eo volume total do circuito, enquanto o ajuste de volume perdido, enquanto a recolha de amostras ^6.

Os passos seguintes são críticos para a execução bem sucedida de experimentos de fluxo:

1. É desejável para evitar formação de bolhas durante o fluxo de set-up, uma vez que as bolhas têm o potencial para arrancar as células de sua superfície. Isto pode ser evitado tomando cuidado ao colocar a parte superior da câmara de fluxo para a parte inferior, o que é melhorrealizado, mantendo ambos paralelos entre si e diminuindo o topo para o fundo em um movimento sem reajustes. Ao fazer isso, pequenas bolhas de ar que possam estar presentes e / ou flutuando no canal de fluxo, serão desviados para as armadilhas de bolha em cada extremidade da carcaça de alumínio.
2. É importante assegurar que a tubulação de saída do reservatório desce para o fundo do reservatório. Caso contrário, o ar pode ser sugado para dentro do tubo que conduz a partir de reservatório para a câmara se o nível de perfusato cai ligeiramente abaixo da extremidade da tubulação.
3. O pesquisador deve estar familiarizado com a direção do fluxo da bomba para que a bomba não acidentalmente correr na direção oposta ao início do fluxo, o que resultaria no ar sendo sugado para dentro do circuito e de câmara.
4. Para evitar a formação de espuma (devido às proteínas desnaturadas contidas no soro), aconselhamos baixar o tubo que conduz da câmara para o reservatório a aproximadamente uma polegada acima do perfusate de nível dentro do reservatório. No entanto, mantendo-o acima do nível médio de fluxo lhe permite verificar o fluxo no reservatório durante o experimento.
5. Quando unir as peças de câmara em conjunto, é importante agarrar firme a habitação com uma das mãos ao operar a chave de fenda elétrica com a outra mão. Note que o movimento da chave de fenda elétrica será traduzido em torque que tem o potencial de "arremessar a câmara em torno de" uma vez que o parafuso é apertado.
6. Para evitar qualquer ondas de pressão de formação no circuito e levantamento de células fora de sua superfície, assegurar que todas as torneiras estão abertos antes de iniciar o fluxo.
7. Especialmente para estudos de fluxo de longo prazo (> 48 horas) recomendamos o uso do tubo mais duro e mais resistente para ser inserido na cabeça da bomba para impedir a quebra da tubulação.
8. É possível que os tubos 'migra' dentro da cabeça da bomba devido a mal-ajustadas dentes cabeça da bomba. Portanto, sugerimos prestando muita atenção à forma como a banheiraing é garantido na cabeça da bomba e marcar cada extremidade do tubo com uma caneta marca de tal forma que você pode facilmente perceber se o tubo é 'puxado' ou deslocada durante o experimento.
9. Sempre verifique cuidadosamente cada conector único do circuito e da câmara antes de iniciar a perfusão, a fim de evitar fugas de perfusato durante um experimento devido a uma conexão defeituosa. Isto é especialmente importante para os conectores de entrada e saída de amortecedores de pulso!
10. Lembre-se de limitar a exposição à luz, se você usar etiquetas fluorescentes.

Uma possível limitação do nosso câmara de fluxo é que a altura é fixado pela altura do canal usinado no alumínio. No entanto, este tem a vantagem de não ter que verificar e ajustar a altura do canal antes de cada experiência e, portanto, simplifica os cálculos tensão de cisalhamento por apenas ajustando o fluxo da bomba para o valor desejado. Dependendo de seus objetivos de pesquisa, pode ser desejávelaumentar a tensão de cisalhamento sem aumentar a velocidade da bomba. Neste caso, recomendamos o aumento da viscosidade do perfusato é, por exemplo, a adição de dextran a ¹¹ médio.

Uma possível limitação do circuito de fluxo é o grande volume de meio utilizado, que pode ser problemático quando se tenta quantificar concentrações muito pequenas de metabólitos celulares. Embora não seja mostrado aqui, é possível reduzir substancialmente o volume do circuito usando um reservatório menor e amortecedor de pulso e diminuir comprimento da tubulação e diâmetro.

Além disso, existem vários outros sistemas disponíveis no mercado que podem ser usados ​​para aplicar tensão de cisalhamento de fluidos para células em cultura. Sistemas baseados em microfluídica, por exemplo, o sistema de BioFlux Fluxion, permitem análises simultâneas de células em diferentes canais de fluxo microfluídicos carregado com solução em placas bem atuando como reservatórios de entrada e de saída para estes canais ^12,13,14. No entanto, essas e outras microsistemas fluídicos não são compatíveis com lâminas de microscópio padrão e não permitir a recuperação de um número suficientemente grande de células para novas experiências, tais como RT-PCR ou Western Blot. Além disso, eles são menos user-friendly, um custo mínimo de US $ 40.000 e pode chegar a um total de mais de US $ 100.000, dependendo do equipamento acessório.

Dois sistemas macrofluidic disponível a partir do FlexCell Internacional Corporation, o Streamer FlexCell e os sistemas FlexFlow, tem sido utilizado com sucesso para estudar células endoteliais ^15,16,17, as células humanas anel ¹⁸ e ¹⁹ fibroblastos em condições de escoamento de fluidos. Um terceiro sistema, disponível através GlycoTech, tem sido utilizada para estudar a adesão de células tumorais ²⁰ e ²¹ a adesão de leucócitos monocamadas endoteliais.

O sistema permite Streamer vários slides para serem executados sob as mesmas condições de tensão de cisalhamento de uma só vez, mas carece de uma janela de visualização e - ao contrário de nossosdesign - não permite a visualização em tempo real de células em fluxo.

O sistema FlexFlow tem uma janela de visualização, mas requer um microscópio vertical, que pode não ser o microscópio padrão usado na maioria dos laboratórios. Além disso, o sistema exige uma FlexFlow lamínula célula revestido de ser invertida quando colocado na câmara de fluxo. Isto impede a visualização de células fluorescentes em uma superfície opaca, como o titânio revestido de vidro, que demonstramos em nosso estudo. Por último, o lamínulas especializados precisam ser comprados especificamente para o sistema FlexFlow, que é na faixa de preço de vários mil dólares, similar ao sistema Streamer FlexCell.

GlycoTech oferece circular e retangular câmaras de placas paralelas de fluxo, que são significativamente menos caro, mas fabricados a partir de acrílico moldado que não podem ser convenientemente tronco autoclavado como a nossa câmara. De nota, câmaras de fluxo de outras que têm sido descritos para ser autoclavávelparecem impraticáveis, pois requerem especial lentes microscópicas ^22,23. O sistema utiliza GlycoTech juntas de borracha de silicone interposta entre as placas superior e inferior, que mudará de espessura com o uso repetido e, portanto, alterar a altura da câmara ao longo do tempo (o fabricante recomenda a compra de novas a cada dez usa). Nossa câmara de alumínio com built-in O-rings permite a completa oposição de placas superior e inferior e altura da câmara garante constante entre experimentos. Por último, bombas de vácuo são necessárias para alcançar um selo à prova de vazamentos em projetos de câmara de fluxo de muitos, incluindo as câmaras GlycoTech, que não são necessárias em nosso projeto.

Considerando não mostrado aqui, a câmara de fluxo pode ser mantido sob um microscópio durante o experimento de vazão em tempo real imagens de adesão celular e / ou comportamento. Se isso for desejado, recomendamos usar lâmpadas de calor ou uma almofada de aquecimento sob a câmara para manter a temperatura do perfusato a 37 ° C. Pelelá, a bomba de roletes pode ser substituído por uma bomba de seringa, se não "recirculação" da células ou metabólitos ou droga investigacional ou agentes é desejado ^24.

Também é possível ao fluxo de células de maneira diferente rotulados sobre células aderentes, por exemplo, plaquetas fluorescentes sobre uma camada de EPCs confluentes (utilizando o ensaio de plaquetas descrito por Achneck et al. ^6,25) para avaliar a célula a célula-interação sob tensão de cisalhamento do fluido. Nossa câmara de fluxo combina recursos valiosos de outras câmaras de fluxo disponíveis, como uma porta de amostragem perfusato e uma janela de visualização e tem a importante vantagem de compatibilidade com qualquer um microscópio invertido ou vertical. É totalmente autoclavável e permite experimentos repetidos na altura da câmara constante e sem a necessidade de bombas de vácuo para conseguir um selo à prova de fugas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Produtos / Reagentes	Companhia	Produto #
Seringa de 10 ml	Cole Parmer Instrument Co.	07940-12
1-Way Stopcoks	Cole Parmer Instrument Co.	30600-00
Seringa 30 ml	BD Medical	309650
4-Way Torneiras	Cole Parmer Instrument Co.	30600-04
Liga de alumínio	N / A	6061
Cultura de células-Pratos (4-bem, rectangular)	Thermo Scientific; Nunc	267061
Rastreador de celular Laranja	Invitrogen	C34551
DMSO	Organics pesquisa	2162D
DPBS (-/-)	Invitrogen	14190-144
EGM-2 Singlequots	Lonza	CC-4176
Adaptador Luer fêmea	Cole Parmer Instrument Co.	SI-45500-04
Fibronectina	Sigma	F0895-2mg
Garrafa de vidro (250ml) com Cap	Cole Parmer Instrument Co.	34594-24
Tubos rígidos	Cole Parmer Instrument Co.	06508-16
HBSS	Sigma	H8264-500ML
Histopaque	Sigma	H8889-500ML
Hoechst Solution Stain	Sigma	H6024
Hyclone FBS	Thermo Scientific	SH30071.01
L-glutamina	Lonza	17-605E
Adaptador Luer macho	Cole Parmer Instrument Co.	EW-45505-04
MCDB-131, 1X Médio	Cellgro	15-100-CV
Acessórios polipropileno farpado	Cole Parmer Instrument Co.	06365-90
O-Rings	N / A	AS568A
Pulso-amortecedor	Cole Parmer Instrument Co.	07596-20
Bomba de acionamento (Masterflex L / S disco economia de velocidade variável)	Cole Parmer Instrument Co.	7524-40
Bomba-Head (Cabeça da bomba Masterflex Fácil Load)	Cole Parmer Instrument Co.	07518-60
Slide	Cole Parmer Instrument Co.	48500-00
Tubulação macia	Cole Parmer Instrument Co.	96400-16
Seringa filtro	Cole Parmer Instrument Co.	02915-12
Sytox Nucleic Acid Orange Stain	Invitrogen	S-11368
Tripsina EDTA	Lonza	CC-5012
Solução de tripsina Neutralizing	Lonza	CC-5002