Aqui nós propor métodos simples para testar e avaliar a presença de espécies reativas de oxigênio nas células.
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Artigo de método
Produção e Detecção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) em Câncer
Neste artigo
Resumo
Resumo
Espécies reativas de oxigênio incluir um número de moléculas que danificam o DNA e RNA e oxidar proteínas e lipídios (peroxydation lipídica). Estas moléculas reativas de oxigênio contêm um e incluem H 2 O 2 (peróxido de hidrogênio), NO (óxido nítrico), O 2 - (ânion óxido), peroxinitrito (ONOO -), ácido hydrochlorous (HOCl) e radical hidroxila (OH -) .
Espécies oxidativas são produzidos não apenas em situações patológicas (câncer, reperfusão isquêmica /, patologias neurológicas e cardiovasculares, doenças infecciosas, doenças inflamatórias 1, doenças auto-imunes 2, etc ...), mas também em situações fisiológicas (não patológicas), tais como o metabolismo celular 3 , 4. De fato, ROS desempenham um papel importante em muitas vias de sinalização celular (proliferação, ativação de células 5, 6, 7 migração etc.). ROS pode ser prejudicial (então é referido como"Stress oxidativo e nitrosativo") quando produzida em quantidades elevadas nos compartimentos intracelulares e células geralmente respondem a ROS por upregulating antioxidantes como a superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa (GSH), que protege convertendo-los perigosos radicais livres em moléculas inofensivas (água, por exemplo). Vitaminas C e E também têm sido descritos como scavengers ROS (antioxidantes).
Os radicais livres são benéficos em pequenas quantidades 3. Macrófagos e neutrófilos mediada por resposta imune envolvem a produção e liberação de NO, que inibe vírus, patógenos e da proliferação do tumor 8. NO também reage com ROS outros e, assim, também tem um papel como um desintoxicante (scavenger ROS). Finalmente NO age em navios para regular o fluxo de sangue que é importante para a adaptação do músculo ao exercício prolongado 9, 10. Várias publicações têm demonstrado também que ROS estão envolvidas na sens insulinaitivity 11, 12.
Vários métodos para avaliar a produção de ROS estão disponíveis. Neste artigo, propomos vários ensaios simples, rápido e acessível, estes ensaios têm sido validados por muitas publicações e são usados rotineiramente para detectar ROS ou dos seus efeitos em células de mamíferos. Embora alguns desses ensaios detectar múltiplas ROS, outros detectam apenas um único ROS.
Protocolo
1. Detecção de ROS usando carboxi-H 2 DCFDA
Carboxi-H 2 DCFDA não é fluorescente, mas na presença de ROS, quando este reagente é oxidado, torna-se verde fluorescente.
- Imediatamente antes da utilização, prepare uma solução estoque fresca de DCFDA 2 carboxi-H em dimetilsulfóxido estéril (DMSO) ou etanol 100%. Evite descongelar múltiplos / congelar os ciclos de sua tintura.
- Lavar as células com tampão HEPES solução de sal (HBSS) ou tampão fosfato (PBS) para remover os vestígios do meio original.
- Carregar as células com o corante (dye eo controle, cf seção de nota). Neste ensaio ....
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Discussão
Várias situações patológicas como doenças inflamatórias, câncer, isquemia / reperfusão, e também tratamentos como a radioterapia ou quimioterapia (cisplatina ou seja) induzem a superprodução de ROS. Assim, a detecção e medição dos níveis de ROS é importante em muitos básica, estudos pré-clínicos e clínicos. No entanto, ROS têm semi-vidas muito curtas e pode ser complicado de detectar. Aqui, propomos testes simples que são usados rotineiramente e amplamente aceites para a detecção de produção de radicais livres em célu.......
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Divulgações
Recebemos o apoio da Promega para esta publicação.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (CA142664).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comments (opcional) |
| 5 - (e-6)-carboxi-2 ', 7'-diacetato diclorofluoresceína (carboxi-DCFDA) | Sondas moleculares | C369 | controle |
| carboxi-H 2 DCFDA | Sondas moleculares | C400 | |
| Sulfanilamida | Sigma | S9251-100G | |
| N-1-napthylethylenediamine dicloridrato | Sigma | N9125-10G | |
| Padrão de nitrito | Sigma | 237213-100G | |
| GSH / GSSG-Glo Assay | Promega | V6612 | Para quantificar oxidado, reduzido ou oxidado / glutationa reduzida |
Referências
- Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).
- Perl, A., Gergely, P., Banki, K. Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythem....
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Reimpressões e permissões
