Alongamento curtas seqüências de DNA com Pinça força constante óptico axial

Resumo

Ilustramos o uso de uma constante de força axial pinças ópticas para explorar as propriedades mecânicas das moléculas de ADN curtas. Esticando DNA axialmente, minimizamos impedimento estérico e artefatos provenientes de manipulação laterais convencional, o que nos permite estudar moléculas de DNA tão curto quanto ~ 100 nm.

Resumo

Molécula única de técnicas de alongamento de ADN de comprimentos de contorno inferior a uma kilobase estão repletas de dificuldades experimentais. No entanto, muitos interessantes eventos biológicos tais como a ligação histona e proteínas mediada por looping de ADN ^{a 1,2,} ocorrem nesta escala de comprimento. Nos últimos anos, as propriedades mecânicas do ADN têm sido mostrados para desempenhar um papel importante em processos celulares fundamentais como a embalagem do ADN em nucleossomas compactos e fibras de cromatina ^3,4. Claramente, é então importante compreender as propriedades mecânicas dos trechos curtos de DNA. Neste artigo, apresentamos um guia prático para uma técnica de uma única molécula de óptica tweezing que temos desenvolvido para estudar o comportamento mecânico de DNA com comprimentos de contorno tão curtos quanto a algumas centenas de pares de bases.

O grande obstáculo no alongamento pequenos segmentos de DNA é que convencionais pinças ópticas são geralmente projetados para aplicar a força em um direction lateral ao estágio ^5,6, (ver fig. 1). Nesta geometria, o ângulo entre o rebordo e as lamelas, para o qual o DNA é presa, torna-se muito íngremes para submicron DNA comprimento. A posição axial deve agora ser considerado, que pode ser um desafio, e, uma vez que a extensão da microesfera arrasta mais perto da lamela, efeitos estéricos são melhoradas. Além disso, como resultado da assimetria das microesferas, as extensões laterais irá gerar vários níveis de binário devido à rotação da microesfera no interior da armadilha óptica uma vez que a direcção das variações de força reactiva durante a extensão.

Métodos alternativos para DNA submicron alongamento correr até contra seus próprios obstáculos únicos. Por exemplo, uma armadilha de duplo feixe óptico é limitada ao estiramento DNA de cerca de um comprimento de onda, em que os efeitos de interferência entre os pontos de duas armadilhas e de dispersão da luz entre as microsferas começam a ser um problema significativo. Substituindo uma das armadilhascom uma micropipeta provavelmente sofrem de desafios semelhantes. Embora se possa utilizar directamente o potencial axial para alongar o DNA, um esquema de feedback ativo que seria necessário para aplicar uma força constante e a largura de banda que será bastante limitado, especialmente em baixas forças.

Nós contornar esses problemas fundamentais diretamente puxando o DNA de distância da lamínula usando uma força constante axial pinças ópticas ^7,8. Isto é conseguido prendendo o grânulo em uma região linear do potencial óptico, em que a força óptica é constante, a força que pode ser ajustada através do ajuste da potência do laser. Prendendo dentro da região linear também serve como um todo óptico força de fixação sobre o ADN que se estende por cerca de 350 nm no sentido axial. Nós simultaneamente compensar o desvio térmico e mecânico com a ajustar com precisão a posição da fase de modo a que uma microesfera referência preso à lamela permanece na mesma posição e foco, umllowing para um período de observação de praticamente ilimitadas.

Protocolo

1. Pinças Setup

1. O feixe de um laser 1064 nm é dividida em dois feixes polarizados ortogonalmente. Um é utilizado para manipular a biomolécula, enquanto o outro é usado para fins de calibração (ver a Fig. 2.).
2. A intensidade do feixe de manipulação é controlada por um deflector acústico-óptico (AOD), enquanto que a posição de focagem e de cada feixe é controlada de forma independente por espelhos de feixe de direcção e telescópios ópticos, respectivamente.
3. Os feixes são então recombinadas com um outro divisor de feixe polarizador e mais condicionada por um conjunto final de óptica de telescopagem para ligeiramente sobrecarregue a abertura....

Discussão

Pinças ópticas convencionais dependem tanto de feedback analógico ou controlado por computador para aplicar uma força constante sobre um objecto refrangente. Estes sistemas de retroalimentação activas têm dificuldade em realizar, em condições em que as alterações súbitas na extensão do espécime ocorrem, por exemplo, a partir da ligação de uma proteína ao ADN ou a intensificação rápida de um motor molecular ao longo de um filamento. Vários métodos para a aplicação de forças passivas constantes foram recentemente desenvol.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente / Equipamento	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Laser Nd: YVO4	Spectra Physics	T40-Z-106C
Óptico-acústico defletor	IntraAction	DTD-274HA6
Objetivo microscópio	Olimpo	PlanApo	60X, NA 1,4
Fase Piezo	Mad City Labs	Nano-LP100	Estágio XYZ
Câmera CCD	PixeLink	PL-A741
Fotodetector	Electro-Optics Tecnologia	ET-3020
Esferas de poliestireno	Spherotech	SVP-08-10	800nm, estreptavidina revestido
Anti-digoxigenina	Roche	De ovelhas
Iniciadores	MWG operon	Oligos personalizados	Um primer: biotina Outros: digoxigenina
PCR reagentes	Nova Inglaterra Biolabs	Taq polimerase, dNTPs
Lamela	Fisher Scientific
Outros produtos químicos para amortecer	Fisher Scientific

11333089001

Materiais suplementares

A. Coeficiente de Fricção hidrodinâmica

Para determinar o coeficiente de atrito hidrodinâmico da microesfera perto de uma superfície pode-se utilizar os ^5,10 expansão seguintes:

onde o h abreviada a seguircomo foram introduzidos:

O coeficiente de atrito é definido em termos de fluido de viscosidade η e o raio da microesfera, com o centro da microesfera, localizada a uma distância acima da superfície η. A soma converge razoavelmente bem quando expandido para cerca de 10 termos.

B. Influência da posição axial em Calibração Rigidez

A calibração da rigidez armadilha envolve uma troca entre a precisão da calibração, que aumenta com o aumento da distância a partir da superfície, e a posição real axial onde a armadilha é usada experimentalmente. Em geral, a armadilha é calibrado em cerca de 800-1000 nm a partir da superfície, que é maior do que a verdadeira condição experimental.

C. Modificado Worm-Like Cadeia Modelo (WLC)

As curvas de extensão da força pode ser ajustado a um WLC modificada modelo que as contas para efeitos de volume de exclusão em vigor óptico zero, como segue:

em que F é a força _opt óptico, _o x é um parâmetro de ajuste para a extensão de força zero, x é a extensão _opt em vigor, l é o comprimento do contorno do DNA, e l * _p é um parâmetro de ajuste para uma segunda eficaz " "comprimento de persistência. _wlc F é dada pelo modelo habitual WLC ¹¹

onde ε é a extensão de DNA relativo.