Stretching korta sekvenser av DNA med konstant kraft Axial optisk pincett

Summary

Vi illustrerar användningen av en konstant kraft axiell optisk pincett att utforska de mekaniska egenskaperna hos korta DNA-molekyler. Genom att sträcka DNA axiellt, minimerar vi steriska hinder och artefakter som uppstår vid konventionell lateral manipulation, vilket tillåter oss att studera DNA-molekyler så korta som ~ 100 nm.

Abstract

Enda molekyl tekniker för stretching DNA kontur längder mindre än en kilobas är förenat med experimentella svårigheter. Men många intressanta biologiska händelser som histon bindning och protein-medierad looping av DNA ^1,2, uppträder på denna längd skala. Under de senaste åren, har de mekaniska egenskaperna hos DNA som visats spela en viktig roll i fundamentala cellulära processer såsom förpackning av DNA i kompakta nukleosomer och kromatin fibrer ^3,4. Uppenbarligen är det då viktigt att förstå de mekaniska egenskaperna hos korta sträckor av DNA. I detta dokument ger vi en praktisk guide till en enda molekyl optisk tweezing teknik som vi har utvecklat för att studera den mekaniska beteendet hos DNA med kontur längder så korta som några hundra baspar.

Den stora hinder i stretching korta segment av DNA är att konventionella optiska pincetter är i allmänhet utformade för att tillämpa kraft i en direction sidled till scenen ^5,6, (se Fig. 1). I denna geometri, blir vinkeln mellan vulsten och täckglaset, till vilken DNA är tjudrad, mycket branta för submikron längd-DNA. Det axiella läget måste nu redovisas, vilket kan vara en utmaning, och eftersom förlängningen drar mikrosfär närmare täckglas är steriska effekter förstärks. Vidare, som ett resultat av asymmetrin hos mikrosfärerna, kommer sidoförlängningar genererar varierande vridmoment på grund av rotationen av mikrosfären i den optiska fällan eftersom riktningen av de reaktiva kraften förändras under förlängningen.

Alternativa metoder för att sträcka submikron DNA stöter sina egna unika hinder. Till exempel är en dubbel-stråle optisk fälla begränsad till sträckning DNA av omkring en våglängd, vid vilken punkt interferenseffekter mellan de två fällor och från ljusspridning mellan mikrosfärerna börjar utgöra ett signifikant problem. Ersätta en av fällornamed en mikropipett skulle sannolikt lider av liknande problem. Medan man kan direkt använda den axiella potentialen att sträcka DNA skulle en aktiv återkoppling system behövas för att tillämpa en konstant kraft och bandbredden av detta kommer att vara ganska begränsad, särskilt vid låga krafter.

Vi kringgå dessa grundläggande problem genom att direkt dra av DNA från täckglaset genom att använda en konstant kraft axiellt optisk pincett ^7,8. Detta uppnås genom att fånga pärlan i en linjär region av optiska potentialen, där den optiska kraften är konstant styrka som kan avstämmas genom justering av lasereffekten. Fångst inom det linjära området fungerar också som en allt optisk kraft-klämman på det DNA som sträcker sig nästan 350 nm i den axiella riktningen. Vi kompenserar samtidigt för termisk och mekanisk drift av fint justering av scenen så att en hänvisning mikrosfär fastnat på täckglas kvar på samma position och fokus, enllowing en praktiskt taget obegränsad observationsperiod.

Protocol

1. Pincett inställning

1. Strålen från en 1064 nm laser uppdelas i två ortogonalt polariserade strålar. En används för att manipulera biomolekylen medan den andra används för kalibrering (se Fig. 2).
2. Intensiteten av manipulering strålen styrs av en akusto-optisk deflektor (AOD), medan positionen och inriktningen hos varje stråle regleras oberoende av speglar strålstyrning och teleskop, respektive.
3. Balkarna sedan återförenas med en annan polariserande stråldelare och konditioneras ytterligare genom en slutlig uppsättning av teleskopiska optik att något överfylla bakre öppning mikroskopobjektivet. En 50% överfyllning för kalibreringen strålen leder till en tät optisk fälla, medan en något mindre faktor för manipulation strålen, ca 20%, ger en grundare fokus som översätter till en större fungerande region av linjära potentialen. Balkarna är tätt fokuseras av en PlanApo 60x/1.4 oljeimmersion mikroskop objektiva på provcellen.
4. Denna pincett inställning är kombinerad med en inbyggd hem brightfield mikroskop som ger belysning från en halogenlampa fokuseras på provkammaren genom en kondensor. Den brightfield bilden separeras från laserljuset genom en dikroisk spegel och därefter avbildas på två CCD-kameror. En CCD fungerar som våra primära sätt att förvärva data och är ett program aktiveras för att ge exakta samplingsfrekvenser, medan den andra CCD används för att bild en enda fast referens mikrosfär vars position fungerar som en feedback-system för att kompensera för drift i mikroskop.
5. Provet grovt placerad med hänsyn till målet med ett XY-steg, och kan sedan noggrant positioneras av en inbäddad tredimensionell piezo-stadiet.
6. Den framåt spridda och överförs laserljus ut av brightfield kondensor och fokuseras på en fotodetektor. Den resulterande signalen filtreras genom ett anti-aliasing-filter vid 100 kHz, förstärks och encquired vid 200 kHz med en DAQ-kort.

2. Kalibrera Skenbar storlek Bead till axiella läge

1. Ladda en provkammare ⁹ med en dispers lösning av 800 nm i diameter polystyren mikrosfärer utspädd i fosfatbuffrad saltlösning. Låt sitta i 10-15 minuter och sedan lätt spola med buffert för att avlägsna överskott av mikrosfärer.
2. Hitta en mikrosfär slumpmässigt fastnat på täckglas och justera höjden på provkammaren tills mikrosfären är ca 1 um under fokus att generera en defokuserad bild.
3. För att mäta den skenbara storleken av bilden, först hitta mitten av mikrosfären med geometriska mönstermatchning funktion i LabView.
4. Därefter genererar en radiell intensitet profil av mikrosfären genom medelvärdesbildning 360 ° kring centrum av varje tvärsnitt. Den radiella profilen, vilket motsvarar en vit ring i varje brightfield bilderna, kan förses med en kvadratisk funktion att hittaen ljusstyrka topp. Avståndet mellan denna topp och centrum kan användas som ett mått på den skenbara storleken på pärlan.
5. Med hjälp av kalibrerade piezostage, gradvis öka det axiella läget av mikrosfären och förvärva en bild vid varje axiell position med CCD-kameran.
6. Upprepa bildanalys för varje successiv bild för att korrelera den skenbara storleken av mikrosfären med dess axiella läge (se Fig. 3). Den axiella upplösning erhålls genom metoden är cirka 1,4 nm ^7.

3. Kartläggning av optiska potential för manipulation Beam

1. Börja med kolinjärt rikta manipulation balken och kalibreringsstrålen. Kalibreringen strålen bör vara cirka 50 mW på baksidan öppning av målet medan manipulation strålen bör vara mycket svagare, säger 10 mW.
2. Med manipulation strålen avstängd, begränsa en fri mikrosfär inom mycket styvare fällan av kalibreringen strålen.
3. Nu startar manipulation balk. Eftersom manipuleringen strålen är mycket svagare än kalibreringsstrålen, kommer den axiella positionen av mikrosfären vara något störd. Den resulterande förändringen i axiell position kan mätas från de defocused ljusfält bilderna som redan beskrivits.
4. Stäng av manipulation balken och med mikrosfären fortfarande instängd i kalibreringsstrålen, flytta axiella fokus kalibreringsstrålen genom att justera den teleskopiska objektivet. Slå på manipulation balk, mäta den efterföljande förskjutning av mikrosfären och upprepa.
5. Den förskjutningar AX kan plottas mot den axiella positionen för fokus kalibreringsstrålen. Den axiella läge motsvarande den största förskjutningen av mikrosfären bestämmer mitten av den linjära regionen av optiska fällan (se Fig. 4).
6. Det slutliga steget för att erhålla den optiska kraft manipuleringen strålen som en funktion av axiell position kräver en noggrann mätning av styvhetkalibreringsstrålen. För att erhålla detta, flyttar mikrosfären, fångade av kalibreringsstrålen, till omkring en mikrometer över ytan genom att justera den teleskopiska objektivet när manipulering strålen är avstängd.
7. Anteckna termiska axiella rörelsen av mikrosfären genom att mäta intensiteten av överfört ljus med en fotodetektor.
8. Autokorrelationen av signalen kan monteras på en enda exponentiell avklingning funktion för att ge tidskonstanten av fluktuationerna,. Τ _z.
9. Den hydrodynamiska friktionskoefficienten ζ av mikrosfären kan korrigeras för mikrosfärerna närhet till en yta ^5,10. Styvheten hos kalibreringen fällan ges då av κ _z = ζ / τ _z (se kompletterande material A och B).
10. Vetskap styvheten av kalibreringen fällan tillåter en att omvandla de tidigare uppmätta axiella förskjutningar i en kraft ƒ _z = κ _z AX Integration av this-kurvan ger en rumslig kartläggning av den axiella optiska potential manipulation strålens (se figur. 4).

4. Stretching ett DNA-prov

1. Montera kammaren ⁹ innehållande ytan förankrade DNA-molekyler (<1 kbp) och utan att frångå brightfield bilden, placera fokus manipulation strålen något över den osträckta mikrosfärerna genom att justera teleskopet. Sedan justera läget av scenen tills en av mikrosfärerna är instängd.
2. Ungefär placera mikrosfär i mitten av XY-planet av den optiska fällan. Skapa en serie av fyrkantiga vågor i LabView och skicka dem till AOD att upprepade gånger slå på laserstrålen på och av. Noggrant styra intensiteten av lasern och varaktigheten av om tillståndet för att förhindra uppvärmning av provkammaren. Vanligtvis använder cirka 2 mW lasereffekt (mätt på baksidan öppning objektiv) och skicka pulser av 200 ms (på) och 500 ms (av). Amplituden hos den fyrkantiga wave skickas till AOD bör ligga runt 0,5 V.
3. Titta på mikrosfär som fällan upprepade gånger slås på och av och notera om lasern framkallar en förmånlig riktning till mikrosfären rörelse. Medan iterativ justering av mikrosfärer positionen i både X-och Y-riktningen, genom att styra piezostage bör slumpmässig rörelse av mikrosfären bli isotropiska i XY-planet, men märkbart begränsad när lasern är på.
4. Därefter rikta vulsten i Z-riktningen. Återigen pulsera laserstrålen till och från medan den här gången, samtidigt mäta mikrosfärerna axiell förskjutning i realtid. Centrum scenen inom det linjära området, vilket är den punkt där Z förskjutningen är störst.
5. Efter en noggrann inriktning i Z-riktningen, är det nödvändigt att kontrollera att fällan fortfarande är centrerad i XY-planet. Om XY anpassning har förändrats måste både XY och Z-anpassningen upprepas tills mikrosfären är centrerad ordentligt längs alla treaxlar.
6. För sträckning av DNA, ramp laserintensiteten genom att sända en spänningssignal till AOD, från 0 V till 0,5 V i steg om 0,025 V. I varje steg, post 400 ramar vid 100 fps och genomsnittliga dem för att erhålla den axiella förskjutningen.
7. The Force förlängning kurvorna kan nu ritas och passa till en modifierad WLC modell ¹¹ (se kompletterande material B).

5. Representativa resultat:

Vi presenterar kurvor kraft förlängning för två DNA-sekvenser: en 1298 bp och en 247 bp sekvens, som är den kortaste sekvensen har vi kunnat sträcka reproducerbart. För korta sträckor av DNA, den konventionella maskliknande Chain (WLC) modell inte förklarar helt sambandet kraften förlängning eftersom det vid dessa längdskalor en måste stå för ändliga storlek effekter och noll kraft förlängning följd av gräns begränsningar. The Force förlängning mätningar därför måste passa med en modifierad WLC modell som har en effective uthållighet längd och en nolla kraft förlängning som passar parametrar, som beskrivs närmare i kompletterande material. För stora kontur längder dsDNA är den effektiva uthållighet längden bara den nominella uthållighet längd (~ 50 nm) och noll kraft förlängningen kan försummas. Emellertid, eftersom konturen längden blir kortare den effektiva längden persistens minskar väl under 50 nm och DNA, även under noll kraft, visar en betydande utvidgning.

De uppgifter och motsvarande anfall av kurvorna kraft förlängning visas i figur. 5 för de två sekvenserna. Från den modifierade WLC passar har vi fastställt de effektiva persistens längd är 35 nm för 1298 bp DNA och 25 nm för 247 bp DNA. För illustrativa syften, presenterar vi enskilda åtgärder kurvorna kraft förlängning för varje sekvens. I praktiken skulle man upprepa de mätningar flera gånger och få de genomsnittliga resultaten tillsammans med de vanliga fel. Det skall också noteras THAt efter att få varje kurva är det viktigt att se till att mikrosfären förblir instängd och korrekt placerad i det linjära området, annars mikrosfären måste läggas om som tidigare beskrivits i protokollet.

Figur 1 Principen av axiella optiska pincetten. (Vänster) Konventionell optisk pincett fälla nära fokus. Pärlan förflyttas sedan lateralt till täckglaset att utöva spänning. (Höger) i axiell optisk pincett, är en mikrosfär fångad bort från fokus, i det linjära området av den optiska potentialen. I denna konfiguration, är polymeren hålls under konstant spänning för en rad förlängningar. Dessutom ökar laserintensiteten förflyttar mikrosfär i den axiella riktningen.

Figur 2 Schematisk representationAxiella optisk pincett laserljus (1064nm Nd: Yvo _4). Delas i två strålar genom passage genom en polariserande stråldelare (PBS). Den manipulation stråle, passerar genom en akusto-optisk deflektor (AOD) och kalibreringen strålen kan justeras oberoende av varandra med hjälp teleskopiska linser. De två strålarna rekombineras sedan med en annan PBS och fokuseras på provet genom en hög NA objektiv. Samtidigt använde ljusfält belysning för att spåra mikrosfären, passerar genom provet, är infraröd (IR), filtrerades och därefter avbildas genom två CCD-kameror, en av vilken tar mätningar medan den andra fungerar som en del av ett återkopplat styrsystem.

Figur 3 axialläge Kalibrering. För att kalibrera den axiella positionen, förvärva vi defocused bilder av en pärla fastnat i kammaren täckglaset vid varierande axiella positioner på scenen. Storleken på microsatmosfären ges av avståndet mellan dess centrum och positionen för maximal intensitet om den ljusa ringen bildas runt bilden av mikrosfären. Den infällda bilden visar den radiella intensitetsfördelningen som ger storleken på pärlan.

Figur 4 Principen bakom Kartläggning av optiska potential. Att kartlägga den optiska kraft manipulation stråle, den axiella förskjutningen att det framkallar en mikrosfär instängd i en mycket starkare kalibreringsstrålen mäts. I mitten av det linjära området där denna förskjutning är ett maximum är belägen. Den optiska Force vs axiellt läge kurva kan integreras för att hitta den optiska potential.

Figur 5 Kraft töjning. Data visas för en slumpmässig 1298 bp och 247 bp (infälld) Segment av dsDNA sträcks genom axiella optisk pincett. De datapunkter passa den modifierade WLC-modellen av eQ. 3 (heldragna linjer) och gav effektiv uthållighet längder 34 nm och 25 nm för 1298bp och 247bp respektive.

Discussion

Konventionella optisk pincett åberopa antingen analog eller datorstyrd återkoppling att applicera en konstant kraft på en ljusbrytande föremål. Dessa aktiva återkopplade system har svårt att utföra under förhållanden där plötsliga ändringar i förlängningen av provet inträffar, till exempel, från bindningen av ett protein till DNA eller snabb stegning av en molekylär motor längs en glödtråd. Olika passiva metoder för att tillämpa konstanta krafter har nyligen utvecklats. En sådan metod, som används för att lösa stegningen av RNA-polymeras vid baspar upplösning, involverade arbetar inom det linjära området av den optiska potentialen av en gaussisk laserstråle ^12. Vi har anpassat denna metod för hantering av korta biomolekyler genom att skapa en konstant kraft axiella optisk pincett.

Axial optisk pincett kan användas för att studera korta sträckor av DNA som är otillgängliga för manipulering av konventionella optiska metoder. De har använts för att stUdy elasticiteten av korta DNA-molekyler så små som några hundra baspar ⁸ och för att sondera effekterna av elastisk spänning på protein-medierad DNA-loopar ^13,14. På kort längdskalor, sekvensberoende effekterna av variationer i vätebindning och stapling energier kan starkt bidra till de elastiska egenskaperna hos DNA. Axial optisk pincett är ett idealiskt verktyg för att avslöja dessa sekvensberoende effekter på DNA elasticitet ^15. Dessutom kommer axiella optisk pincett vara ett känsligt verktyg för att studera inslagning av DNA kring enskilda histoner och sondering den verksamhet som bedrivs snabbt bearbetning molekylär motor och skulle visa sig vara en värdefull ny teknik i enda molekyl verktygslåda.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Equipment	Company	Catalog number	Comments
Nd:YVO4 laser	Spectra Physics	T40-Z-106C
Acousto-optic deflector	IntraAction	DTD-274HA6
Microscope Objective	Olympus	PlanApo	60X, NA 1.4
Piezo stage	Mad City Labs	Nano-LP100	XYZ stage
CCD camera	PixeLink	PL-A741
Photodetector	Electro-Optics Tech	ET-3020
Polystyrene Beads	Spherotech	SVP-08-10	800nm, streptavidin coated
Anti-digoxigenin	Roche	11333089001	From sheep
Primers	MWG operon	Custom oligos	One primer: biotin Other : digoxigenin
PCR reagents	New England Biolabs	TAQ polymerase, dNTPs
Coverglass	Fisher Scientific
Other chemicals for buffer	Fisher Scientific
Supplementary Materials
A. Hydrodynamic Friction C–fficient
For determining the hydrodynamic friction c–fficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion5,10:
where the following shorthand has been introduced:
The friction c–fficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere's center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms.
B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration
The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition.
C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model
The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows:
where Fopt is the optical force, xo is a fit parameter for the zero force extension,xopt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*p is a second fit parameter for an "effective" persistence length. Fwlc is given by the usual WLC model11 where ε is the relative DNA extension.