Alongamento curtas seqüências de DNA com Pinça força constante óptico axial

O objetivo geral deste procedimento é manipular moléculas de DNA curtas com comprimento de 100 nanômetros utilizando forças ópticas constantes e bem calibradas. Isso é realizado fixando uma extremidade do DNA em uma lamínula e a outra em uma microesfera de poliestireno. Em seguida, os pinças ópticas são alinhadas e calibradas.

Em seguida, o DNA é esticado para longe da superfície por meio de uma combinação de forças gradientes e forças de dispersão atuando na microesfera. Por fim, o DNA é alongado aprisionando a esfera na região linear do potencial. O protocolo tem sido utilizado para estudar as propriedades mecânicas do DNA e a cinética de ligação entre DNA e proteínas, além de ter sido útil para elucidar a importância das condições de contorno na elasticidade de construtos de DNA curtos.

Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois o alinhamento e a calibração das pinças ópticas de força constante são difíceis e complexos. As pinças ópticas incluem um feixe de um laser de 1064 nanômetros que é dividido em dois feixes ortogonalmente polarizados. Um é usado para manipular a biomolécula e o outro é usado para fins de calibração.

A intensidade do feixe de manipulação é controlada por um defletor óptico acusto-óptico ou por um atenuador óptico. Os feixes são então recombinados com outro divisor de feixe polarizador. Os feixes são fortemente focalizados por uma objetiva microscópica plan APO 60 x 1,4 com imersão em óleo sobre a célula da amostra. Esta configuração de pinça óptica é combinada com um microscópio de campo claro construído em laboratório, que fornece iluminação a partir de uma lâmpada de halogênio focalizada na câmara da amostra por um condensador.

A imagem de campo claro é separada da luz do laser por um espelho dicróico e, em seguida, direcionada a duas câmeras CCD. Uma das câmeras CCD atua como nosso principal meio de aquisição de dados e é acionada por software para fornecer taxas de amostragem precisas. Enquanto isso, a outra câmera CCD é usada para imagens de uma única microesfera de referência presa, cuja posição serve como um sistema de controle de realimentação para compensar a deriva no microscópio.

A amostra é posicionada grosseiramente em relação ao objetivo por meio de uma platina XY e, em seguida, pode ser posicionada com precisão por uma platina piezoelétrica embutida tridimensional. A luz laser dispersa para frente e transmitida é coletada pelo condensador de campo claro e focalizada em um fotodetector para calibrar o tamanho da esfera, carregar uma câmara de amostra com uma solução dispersa de microesferas de poliestireno com diâmetro de 800 nanômetros diluídas em solução salina tamponada com fosfato. Deixe repousar por 10 a 15 minutos e, em seguida, lave suavemente com tampão.

Para remover microesferas em excesso, localize uma microesfera presa aleatoriamente ao vidro de cobertura e ajuste a altura da câmara de amostra até que a microesfera esteja aproximadamente um micrômetro abaixo do foco. Para gerar uma imagem desfocada e medir o tamanho aparente da imagem usando o LabVIEW, primeiro encontre o centro da microesfera utilizando a função de correspondência de padrão geométrico. Em seguida, gere um perfil radial de intensidade da microesfera fazendo a média em 360 graus.

No centro de cada seção transversal, ajuste o perfil radial, que corresponde a um anel branco em cada uma das imagens de campo claro, utilizando uma função quadrática. Para identificar um pico de brilho, a distância entre esse pico e o centro pode ser usada como uma medida do tamanho aparente da esfera; utilizando a plataforma calibrada, aumente gradualmente a posição axial da microesfera e adquira uma imagem em cada posição axial com a câmera CCD. Repita a análise de imagem para cada imagem sucessiva a fim de correlacionar o tamanho aparente da microesfera com sua localização axial.

A resolução axial obtida por este método é de cerca de 1,4 nanômetros para mapear o potencial óptico do feixe de manipulação, começando por colinear, alinhando o feixe de manipulação e o feixe de calibração com o feixe de manipulação desligado. Confinar uma microesfera livre dentro do aprisionamento muito mais rígido do feixe de calibração. Agora, ligue o feixe de manipulação.

Como é muito mais fraco do que o feixe de calibração, a posição axial da microesfera será ligeiramente perturbada. A alteração resultante na posição axial pode ser medida a partir das imagens de campo claro desfocadas, conforme já descrito. Desloque o foco axial e repita, representando graficamente o deslocamento delta X em função da posição axial do foco do feixe de calibração.

A posição axial correspondente ao maior deslocamento da microesfera determina o centro da região linear do armadilhamento óptico. Para esticar uma amostra de DNA, monte a câmara contendo moléculas de DNA ancoradas à superfície e, enquanto observa a imagem de campo claro, posicione o foco do feixe de manipulação ligeiramente acima das microesferas não esticadas ajustando o telescópio; em seguida, ajuste a posição da platina até que uma das microesferas seja aprisionada. Posicione aproximadamente a microesfera no centro do plano XY do armadilhamento óptico, gere uma série de ondas quadradas no LabVIEW e envie-as ao AOD para ligar e desligar repetidamente o feixe a laser.

Observe a microesfera enquanto o armadilhamento é ligado e desligado repetidamente. E observe se o laser induz alguma direção preferencial ao movimento da microesfera enquanto ajusta iterativamente a posição da microesfera nas direções X e Y. Ao controlar o estágio de piso, o movimento aleatório da microesfera deve tornar-se isotrópico no plano X-Y, embora visivelmente restrito quando o laser está ligado.

Em seguida, alinhe o microesfera na direção Z. Novamente, pulse o feixe de laser ligando e desligando. Desta vez, medindo simultaneamente o deslocamento axial das microesferas em tempo real.

Centralize a platina na região linear, que é o ponto onde o deslocamento em Z é máximo para esticar a rampa de DNA, ajustando a intensidade do laser mediante envio de um sinal de tensão ao A OD, variando de zero volts a 0,5 volts em incrementos de 0,025 volts a cada passo. Registre 400 quadros a 100 quadros por segundo e faça a média deles para obter o deslocamento axial. Por fim, trace as curvas de força versus extensão e ajuste-as a um modelo de cadeia semelhante a um verme modificado.

Mostram-se aqui curvas de força-extensão para sequências de NA 2D, com 1, 298 pares de bases e 247 pares de bases de comprimento, para trechos curtos de DNA. O modelo convencional de cadeia semelhante a um verme, ou WLC, não explica completamente a relação entre força e extensão, pois nessas escalas de comprimento é necessário levar em conta os efeitos de tamanho finito e a extensão em força zero decorrentes de restrições de fronteira. As medições de força-extensão devem, portanto, ser ajustadas utilizando um modelo WLC modificado, que possui um comprimento de persistência efetivo e uma extensão em força zero como parâmetros de ajuste descritos mais detalhadamente nos materiais suplementares.

Para grandes comprimentos de contorno de D-S-D-N-A, o comprimento de persistência efetivo é simplesmente o comprimento de persistência nominal, cerca de 50 nanômetros, e a extensão em ausência de força pode ser desprezada nos ajustes modificados do modelo WLC. Os comprimentos de persistência efetivos são de 35 nanômetros para o DNA de 1.298 pares de base e de 25 nanômetros para o DNA de 247 pares de base após seu desenvolvimento. Este método abriu caminho para uma variedade de medições nanomecânicas em DNA e complexos de DNA com proteínas, incluindo um estudo da cinética da formação e dissociação de alças de DNA mediadas por proteínas regulatórias.