Artigo de método

Seleção e isolamento de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos adultos reprogramado

DOI:

10.3791/3416

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20 de fevereiro de 2012

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1Department of Molecular Carcinogenesis and Center for Cancer Epigenetics, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, 2Department of Cell Biology, Poznan University of Medical Sciences, 3Department of Molecular Biology, The Scripps Research Institute

Neste artigo

Resumo

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Nós apresentamos um protocolo para a reprogramação eficiente de células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) usando vetores retrovirais codificando OCT3 / 4, Sox2, KLF4 e c-myc (OSKM) e identificação de hiPSC corretamente reprogramado pela coloração ao vivo com tradi- 1-81 anticorpo.

Resumo

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Apresentamos aqui um protocolo de reprogramação fibroblastos humanos adultos em humanos células pluripotentes induzidas estaminais (hiPSC) utilizando vectores retrovirais que codificam OCT3 / 4, Sox2, KLF4 e c-myc (OSKM) na presença de butirato de sódio 1-3. Usamos este método para reprogramar passagem tardia (> p10) fibroblastos humanos adultos provenientes de paciente ataxia de Friedreich (GM03665, Coriell Repository). A abordagem de reprogramação inclui protocolo de transdução altamente eficiente utilizando centrifugação repetitiva de fibroblastos na presença de vírus que contêm meios de comunicação. As colónias hiPSC reprogramadas foram identificadas utilizando imunomarcação vivo para Tra-1-81, um marcador de superfície de células pluripotentes, separados a partir de fibroblastos não-reprogramadas e manualmente passadas 4,5. Estes hiPSC foram então transferidas para placas de Matrigel e cultivadas em condições isentas de alimentação, directamente a partir da placa de reprogramação. A partir da primeira passagem, as colónias hiPSC demonstrar característica HES-lmorfologia ike. Usando este protocolo mais do que 70% das colónias seleccionadas pode com sucesso ser expandido e estabelecido em linhas celulares. As linhas estabelecidas hiPSC exibido característicos marcadores de pluripotência incluindo marcadores de superfície TRA-1-60 e SSEA-4, bem como marcadores nucleares OCT3 / 4, Sox2 e Nanog. O protocolo apresentado aqui tenha sido estabelecida e testadas usando fibroblastos adultos obtidos a partir de pacientes com AF e indivíduos de controlo 6, fibroblastos humanos recém-nascidos, bem como queratinócitos humanos.

Protocolo

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1. Produção de vírus e de transdução

  1. Plate Phoenix células ampho a uma densidade de 8x10 ~ 7-6 por placa de 10 cm em 10 ml de meio DMEM (DMEM glucose elevada, 10% de FBS inactivado calor, 2 mM de L-glutamina, sem antibióticos). Lugar na incubadora e da cultura durante a noite a 37 ° C, 5% de CO 2.
  2. No dia seguinte, transfectar células Phoenix, utilizando 12 ug de um vector de codificação quer OCT3 / 4, Sox2, KLF4, c-myc, ou GFP gene (Addgene plasmídeos 17.217, 17.218, 17.219, 17.220) e 35 uL Fugene 6. Preparar a mistura de transfecção em 500 uL de meio DMEM (DMEM glucose elevada, 2 mM de L-glutamina, sem FBS e antibióticos). ....

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Discussão

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O estudo de doenças humanas, especialmente neurológicas e neurodegenerativas, foi particularmente difícil devido à falta de acesso aos humanos adequados modelos de celulares. A capacidade de reprogramar células somáticas de fácil obtenção em células tronco pluripotentes induzidas e potencial para diferenciá-las em diversos tipos celulares abriu uma possibilidade de criar modelos celulares de doenças genéticas. Além disso, iPSCs realizar uma grande promessa para o futuro da medicina regenerativa. Portanto, é essencial pa.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Aliança de Friedreich Ataxia Research e uma subvenção piloto da Família Arnold Foundation e O Centro de Células-Tronco e Biologia do Desenvolvimento no MD Anderson Cancer Center.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagente Companhia Número de Catálogo
DMEM Invitrogen 11965
DMEM/F12 Invitrogen 11330
KSR Invitrogen 10828
Aminoácidos não essenciais Invitrogen 11140
Butirato de sódio Sigma B5887
Y27632 Stemgent 04-0012
bFGF Stemgent 03-0002
Tra-1-81 anticorpo Stemgent 09-0069
OCT3 / 4 anticorpo Santa Cruz sc-8628
Nanog anticorpo Cell Technology Sinalização 4903S
Tra-1-60 anticorpo Millipore MAB4360
Sox2 anticorpo Cell Technology Sinalização 3579S
SSEA4 Millipore MAB4304
CF1 MEFs Globalstem GSC-6201G
Marcador objetivo Nikon MBW10010
Matrigel BD Biosciences 354277
mTeSR1 StemCell Technologies 05850
β-mercaptoetanol Sigma M7522
Fugene 6 Roche 11814443001
polibrene Sigma H9268
Marcador de objeto Nikon MBW10010

Referências

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  1. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Mali, P., Chou, B. K., Yen, J., Ye, Z., Zou, J., Dowey, S., Brodsky, R. A., Ohm, J. E., Yu, W., Baylin, S. B., Yusa, K., Bradley, A., Meyers, D. J., Mukherjee, C., Cole, P. A., Cheng, L.

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Etiquetas

Transdu o de Vetor RetroviralReprograma o de FibroblastosImunomarca o de Tra 1 81C lulas Alimentadoras Embrion rias de CamundongoTratamento com Butirato de S dioProtocolo de Isolamento de Col niasAn lise de Marcadores de Pluripot nciaCondi es de Cultura Sem AlimentadoresEfici ncia de Transdu o de GFP

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