Isolando-LacZ expressar Células de tecidos de camundongos Inner Ear usando Citometria de Fluxo

Resumo

A citometria de fluxo é uma ferramenta poderosa que permite o isolamento e o estudo de populações de células específicas. Este protocolo descreve as etapas para isolar células que expressam LacZ de tecidos cocleares de camundongos transgênicos neonatais. As células cocleares dissociadas foram marcadas usando substratos conjugados fluorescentes de β-galactosidase antes da separação por citometria de fluxo.

Resumo

O isolamento de tipos específicos de células permite analisar populações de células raras, como células-tronco/progenitoras. Essa abordagem para estudar os tecidos do ouvido interno apresenta um desafio único devido à escassez de células de interesse e poucos modelos de camundongos repórteres transgênicos. Aqui, descrevemos um protocolo usando sondas conjugadas com fluorescência para marcar seletivamente células LacZ-positivas da cóclea neonatal.

A patologia subjacente mais comum da perda auditiva neurossensorial é o dano irreversível e a perda das células ciliadas sensoriais da cóclea, que são necessárias para transduzir ondas sonoras em impulsos neurais. Evidências recentes sugerem que os órgãos auditivos e vestibulares murinos abrigam células-tronco/progenitoras que podem ter potencial regenerativo^1,2. Esses achados justificam uma investigação mais aprofundada, incluindo a identificação de tipos específicos de células com características de células-tronco/progenitoras. A via de sinalização Wnt demonstrou desempenhar um papel crítico na manutenção de populações de células-tronco / progenitoras em vários sistemas^{de órgãos 3-7}. Recentemente, identificamos células que expressam Axin2 responsivas a Wnt na cóclea neonatal, mas sua função é amplamente desconhecida⁸.

Para entender melhor o comportamento dessas células responsivas a Wnt in vitro, desenvolvemos um método de isolamento de células que expressam Axin2 da cóclea de camundongos repórteres Axin2-LacZ⁹. Usando citometria de fluxo para isolar células positivas para Axin2-LacZ da cóclea neonatal, poderíamos, por sua vez, executar uma variedade de experimentos em células vivas para interrogar seu comportamento como células-tronco / progenitoras. Aqui, descrevemos em detalhes as etapas para a microdissecção da cóclea neonatal, dissociação desses tecidos, marcação das células LacZ-positivas usando um substrato fluorogênico e classificação celular. Técnicas para dissociar cócleas em células únicas e isolar células cocleares por citometria de fluxo têm sido descritas^2,10-12. Fizemos modificações nessas técnicas para estabelecer um novo protocolo para isolar células que expressam LacZ da cóclea neonatal.

Protocolo

1. Microdissecção da cóclea

1. Prepare o microscópio de dissecção sob o capô, limpando as superfícies com etanol a 70% e colocando blocos de gelo.
2. Prepare 10-15 placas de Petri de 35 mm em condições estéreis e encha até a metade (~ 2 ml) com solução salina balanceada de Hank estéril com cálcio (HBSS).
3. Prepare duas placas de Petri de 35 mm em condições estéreis e encha até a metade (~ 2 ml) com solução estéril 1x tamponada com fosfato (PBS).
4. Esterilize micropinças em tubo Falcon cônico de 50 ml com etanol a 70%.
5. Em uma sala separada do capuz estéril, use uma tesoura de íris para decapitar camundongos repórter Axin2^LacZ/+ pós-natal (P) de 0-3 dias de idade e coloque as cabeças em uma placa de Petri de 60 mm em bloco de gelo.
6. Usando uma pinça Dumont # 5 e uma tesoura de íris, excise a mandíbula e a língua e corte a base do crânio na altura do palato.
7. Remova a pele sobrejacente da calvária e corte a base do crânio inserindo a tesoura na parte inferior do forame magno até o meio do palato.
8. Faça outra incisão com tesoura de íris da borda cortada do palato até a face superior da calvária em ambos os lados, tomando cuidado para não danificar a cápsula ótica.
9. Isolamento completo do osso temporal fazendo duas incisões angulares de 45 graus a partir da face superior do forame magno estendendo-se até o corte coronal no palato duro.
10. Coloque os ossos temporais isolados em placas de Petri de 35 mm contendo HBSS em bloco de gelo.
11. Colete ossos temporais de cerca de 12 a 15 animais que foram sacrificados, para um total de 24 a 30 ossos temporais.
12. Transferir a placa de Petri com os ossos temporais isolados para uma campânula de dissecção estéril previamente preparada (1.1).
13. Transferir quatro ossos temporais para cada placa de Petri de 35 mm pré-preparada contendo HBSS (1.2) e colocá-los sobre um bloco de gelo.
14. Comece a microdissecção usando duas pinças # 55 para remover suavemente o córtex, o tronco cerebral e o cerebelo no osso temporal que cobre a cápsula ótica.
15. Sem remover a cápsula ótica, desbaste-se de partes da cápsula coclear começando na entrada do nervo vestibulococlear na cápsula ótica.
16. Após a exposição da base da cóclea, puxe suavemente a cóclea e os tecidos circundantes. Remova qualquer gânglio espiral remanescente e a estria vascular começando na base.
17. Transferir a cóclea para uma placa de Petri de 35 mm contendo PBS em bloco de gelo.
18. Para uma viabilidade ideal do tecido, o tempo total de dissecção deve ser inferior a 60 min.
19. Repita as etapas acima para 3-5 camundongos P0-P3 do tipo selvagem (WT) como controles para camundongos Axin2-LacZ.

2. Dissociação celular (modificada a partir de métodos descritos anteriormente)^2,10

1. Coloque 50 μl de PBS estéril no centro de um poço em uma placa de cultura não revestida de 6 poços.
2. Transfira até 20 cócleas Axin2^LacZ/+ para cada gota de 50 μl de PBS. Uma nova gota de 50 μl de PBS deve ser usada para mais de 20 cócleas.
3. Pré-aqueça alíquotas de 50 μl de tripsina a 0,125% por ~ 2 minutos em banho-maria a 37 ° C.
4. Adicione 50 μl de tripsina a 0,125% pré-aquecida ao PBS contendo a cóclea.
5. Coloque o prato de 6 poços a 37°C por 8 min, tomando cuidado para não agitar o prato.
6. Para encerrar a tripsinização, adicione 50 μl de inibidor de tripsina de soja a cada gota de 100 μl.
7. Adicione mais 50 μl de Full Media (FM) (IGF-1, EGF, bFGF, HS, ampicilina em DMEM/F12)²
8. Usando uma ponta de pipeta romba de 300 μl com um pipetador p200 ajustado em 125 μl, triture suavemente as células 80 vezes, tomando cuidado para não criar bolhas.
9. Após a trituração de cada gota, adicione mais 200 μl de FM a cada poço.
10. Passe as células através de um filtro de células Falcon azuis de 40 μm para um novo poço.
11. Transfira as células para tubos Falcon FACS padrão (aproximadamente 300 μl permanecem após trituração e filtração).
    1. Divida as células das cócleas selvagens em três tubos, diluindo 100 μl com 300 μl de FM em cada tubo. Um tubo será usado como controle em branco, um será corado apenas com iodeto de propídio (PI, 1 μg/ml) (não deve ser adicionado nesta etapa), enquanto o último será corado com 3-carboxiumbelliferil β-D-galactopiranosídeo (CUG, ver 2.15) para detectar fluorescência de fundo.
    2. Colocar 400 μl de células dissociadas da cóclea Axin2-LacZ em cada tubo FACS. Como um controle apenas CUG, dilua 10 μl de células em 390 μl FM (consulte o tubo F na Etapa 2.15). Traga o volume de quaisquer tubos restantes para 400 μl.
12. Incube as células em uma incubadora umidificada a 37 ° C por 10 min.
13. Prepare a solução CUG:
    1. Prepare 200 μl de CUG para cada tubo FACS que requer coloração.
    2. Dilua o CUG em FM 1:50 em um capuz escuro com exposição mínima à luz.
    3. CUG diluído pré-aquecido a 37°C por 3-5 minutos.
14. Em seguida, adicione 200 μl de CUG diluído a cada tubo FACS apropriado. Para tubos não designados para ter CUG, adicione apenas FM (consulte 2.15).
15. Neste momento, deve haver cinco categorias de tubos com o seguinte conteúdo (não adicione PI nesta etapa):
    1. Wildtype - sem CUG ou PI (para compensação, consulte a etapa 3.5-6)
    2. Wildtype - apenas com PI (para compensação)
    3. Wildtype - com CUG e PI (para controle contra células Axin2-LacZ)
    4. Axin2-LacZ - apenas com CUG (para compensação)
    5. Axin2-LacZ - com CUG e PI (para classificação real de células)
    6. Axin2-LacZ - com CUG e PI (para análise de eventos)
16. Proteja todos os tubos da luz e incuba-os em uma incubadora umidificada a 37°C por 25 minutos.
17. Prepare uma solução fresca de HEPES + soro fetal bovino (FBS) para interromper a reação após a incubação:
    1. Diluir 400 μl de FBS recém-descongelado em 10 ml de HEPES estéril a 10 mM (em PBS) em um tubo Falcon de 15 ml.
    2. Colocar o tubo no gelo até completar o ponto 2.16.
18. Adicione 1,8 ml de solução HEPES gelada a cada tubo FACS sob um capuz estéril com as luzes apagadas para minimizar a exposição à luz.
19. Centrifugue as células a 1200 rpm por 5 minutos.
20. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 300 μl FM, agrupar todas as alíquotas para a amostra de triagem (Axin2-LacZ corado com CUG e PI).
21. Adicione PI a cada tubo para atingir uma concentração final de 1 μg/ml.
22. Coloque as células no gelo e proteja-as da luz.

3. Citometria de fluxo

1. Usamos um BD Aria II equipado com lasers de 488 nm, 633 nm e 407 nm. A detecção de CUG foi feita usando o laser violeta de 407 nm e PI usando o laser azul de 488 nm no Stanford Shared FACS Facility.
2. É necessário um operador de citômetro de fluxo treinado. Prossiga para a próxima etapa depois de aquecer os lasers, calibrar os detectores do citômetro usando as instruções do fabricante e definir os parâmetros de classificação ideais. Em nossa experiência, descobrimos que o uso de um bico de 100 μm otimiza a viabilidade celular para experimentos subsequentes.
3. Os seguintes parâmetros foram usados: limiar em 5.000 eventos, vazão inferior a 3.000 eventos/segundo, espalhamento direto (FSC) em 125 volts e espalhamento lateral (SSC) em 250 volts, canal PE-Cy5 foi usado para PI e Cascade Blue para CUG.
4. Lave a câmara do citômetro com etanol a 70% e PBS duas vezes cada nessa ordem.
5. Comece a análise com células selvagens não coradas (tubo A na Etapa 2.15). Colete 1.000 eventos para determinar a distribuição celular no gráfico FSC versus SSC. Se a dispersão não for desejada, ajuste os parâmetros FSC e SSC.
6. Execute a compensação usando células WT não coradas (tubo A), WT coradas com PI (tubo B) e Axin2-LacZ coradas com CUG (tubo D). A compensação permitirá uma discriminação de sinal mais precisa entre os diferentes comprimentos de onda do laser.
7. Inicie a análise com células coradas com PI e CUG de tipo selvagem (tubo C) e defina parâmetros de gating para:
   1. Exclusão de detritos com base no gráfico FSC versus SSC.
   2. Exclusão de gibões e aglomerados usando o gráfico de altura FSC versus área FSC.
   3. Exclusão de células mortas com base no gráfico da área FSC versus área PE-Cy5.
   4. Configure o gráfico da área FSC versus a área azul da cascata com qualquer colocação de portão.
8. Em seguida, analise 10.000 eventos do tubo de amostra de classificação que contém células coradas com Axin2-LacZ PI e CUG (tubo F).
   1. Todas as portas definidas usando células wildtype devem ser aplicadas aqui.
   2. Usando gráficos para as células wildtype, crie portas para células Cascade Blue-high que sejam menos de 1% do número total de eventos.
   3. Essas mesmas portas do Cascade Blue-high agora abrangem aproximadamente 15-20% das células na amostra Axin2-LacZ, tornando essas células Axin2-high.
   4. Usando o gráfico de análise das células Axin2-LacZ, crie uma porta para os 15-20% menos fluorogênicos das células, doravante células Axin2-low.
9. Com base na estratégia de gating acima mencionada, classifique as células em tubos FACS contendo 500 μl de FM, um tubo para células Axin2-high e outro para células Axin2-low. Certifique-se de que os tubos de coleta estejam em uma câmara resfriada a 4°C durante a classificação.
10. Número recorde de células contadas por citômetro de fluxo para cada população.

4. Resultados representativos (ver Figura 2):

Com o protocolo acima, normalmente recuperamos 40-45% de células livres de detritos tanto da cóclea selvagem quanto da cóclea Axin2^LacZ/+ (Figuras 2A e B), com cerca de 70% delas livres de gibões (ver Figuras 2A' e B'). A maioria das células classificadas é viável e não absorveu IP (~ 95%) (Figuras 2A '' e B ''). Em média, as principais ~ 20% de células positivas para CUG são consideradas células positivas para Axin2-LacZ (Figura 2B ''') e se correlacionam com cerca de 15.000 células de alta Axin2-LacZ por 10-12 animais.

A análise de reclassificação por citometria de fluxo de células Axin2-high revelou pureza superior a 93% no canal Cascade Blue. Para confirmar ainda mais a identidade dessas células, realizamos imunocoloração pós-classificação de células Axin2-high e Axin2-low usando anticorpos anti-β-galactosidase e descobrimos que as células Axin2-high continham ~ 93,4% de células positivas para β-galactosidase (mais de 1.500 células analisadas) e que as células Axin2-low continham ~ 4,8% de células positivas para β-galactosidase.

Figuras e Tabelas:

Figura 1.Paradigma experimental. A figura acima descreve a estratégia e as técnicas experimentais gerais, conforme descrito na seção de protocolo. Cócleas de camundongos selvagens e Axin2^LacZ/+ são colhidas e dissociadas em células únicas, que foram então tratadas com CUG, um substrato fluorescente para β-galactosidase. As células Axin2-LacZ-high e -low foram então separadas por citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão em tamanho real desta imagem.

Figura 2.Estratégias de Gating. Esta figura ilustra as estratégias de canais de citometria de fluxo usadas. A) Células de tipo selvagem dissociadas que foram submetidas ao mesmo tratamento que as células Axin2-LacZ são analisadas aqui usando um total de 10.000 eventos. O primeiro painel demonstra a área de dispersão lateral (SSC-A) versus a área de dispersão direta (FSC-A). Aqui, um grupo distinto de eventos é de um tamanho muito maior do que os eventos mais próximos do eixo y. Esses eventos são designados como "Detritos Negativos". A próxima porta, A', analisa as células "Debris Negative" do painel A, que representam 43,8% do número total de eventos (veja a tabela abaixo). Neste painel, a altura de dispersão direta (FSC-H) versus a FSC-A é usada para excluir duplicatas. Eventos que se desviam da natureza linear esperada do gráfico são excluídos. Essa preparação normalmente produz ~ 70% de eventos dentro do portão designado e as células restantes são excluídas. No painel A'', o iodeto de propídio (PI), detectado pelo canal PE-Cy5, é usado para marcar células mortas (5,3%). No próximo painel (A'''), o canal azul Cascade é usado para detectar o substrato fluorescente CUG. Aqui, os portões LacZ-high incluem menos de 1% do total de eventos. B) Células dissociadas de camundongos Axin2-LacZ tratados com CUG e PI são analisadas aqui usando um total de 10.000 eventos. Portas idênticas do painel A são aplicadas aqui. B' mostra que 29,5% das células são excluídas como duplicatas, enquanto B'' demonstra que 5,4% não são viáveis. As portas iniciais para células LacZ-high e -low são desenhadas usando o painel B''' com LacZ-high inicialmente definido em 19,7% e LacZ-low em 20,4%. Clique aqui para ver uma versão em tamanho real desta imagem.

    Número do evento porcentagem um Análise de tipo selvagem 10.000   UMA' Detritos negativos 4.381 43.80% de sucesso Um '' Duplo Negativo 3.116 71.10% de sucesso Um ''' PI Negativo 2.951 94.70%   LacZ-alto 16 0,54% de sucesso   LacZ-baixo 2.790 94.50% de sucesso O Análise – Axin2-LacZ 10.000   B' Detritos negativos 4.218 42,2% de sucesso B'' Duplo Negativo 2.973 70.50% de sucesso B''' PI Negativo 2.813 94,6% de sucesso   LacZ-alto 553 19.70% de sucesso   LacZ-baixo 573 20.40%

Tabela 1. Análises quantitativas das estratégias de gating na Figura 2.

Discussão

Pesquisas independentes caracterizaram capacidade regenerativa limitada dentro da cóclea neonatal^2,10,12,13. Usando camundongos repórter GFP e citometria de fluxo, White e colegas isolaram células de suporte cocleares específicas e descobriram que elas tinham características de células progenitoras¹².

A via Wnt canônica demonstrou marcar populações de células-tronco/progenitoras em vários sistemas de órgãos, incluindo cérebro, glândula mamária, sistema hematopoiético, pel...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de Petri, poliestireno, estéril Geriner Bio-one 35 x 10 mm	VWR international	82050-540
BD Filtros de Células Falcon, Estéril, BD Biosciences, azul, 40 μ m	VWR internacional	21008-949
Hanks' Solução salina balanceada (HBSS). Solução com Cálcio, Magnésio e sem Vermelho de Fenol, Estéril	VWR international	45000-456
Tubos de centrífuga Cellstar, polipropileno, estéreis, greiner bio-one, 50 ml	VWR international	82050-346
Cellstar tubos de centrífuga, polipropileno, estéreis, greiner bio-one, 15 ml	VWR international	82050-278
B-27 Suplemento sem soro (50x), líquido	Invitrogen	17504-044
N-2 Suplemento (100x), líquido	Invitrogen	17502-048
bFGF, fator de crescimento de fibroblastos-humano básico	Sigma-Aldrich	F0291
IGF-1, fator de crescimento semelhante à insulina-1 de camundongo	Sigma-Aldrich	I8779
EGF, fator de crescimento epidérmico humano	Sigma-Aldrich	E9644
Dulbecco' s Águia Modificada' s Médio/Presunto' s F-12 50/50 Mix: 1X, com L-Glutamina e 15 mM HEPES	VWR international	45000-350
BD Falcon Tubos de fundo redondo, descartáveis, poliestireno, 12x75	VWR international	60819-295
Tripsina, 0,25% (1X) com EDTA 4Na, líquido	Invitrogen	25200-056
ep Dualfilter TIPS 300uL, 960 TIPS	Eppendorf	22491245
tripsina, Soja, Purificado	Worthington Biochemical	LS003570
BD Falcon 40um Cell Strainers	BD Biosciences	21008-949
Placas multipoços, poliestireno, Greiner Bio-One, Placas não tratadas, 6 poços	VWR international	82050-846
Marker Gene FACS Blue LacZ beta-Galactosidase Detection Kit	Marker Gene Technologies	M0255