Artigo de método

Isolando-LacZ expressar Células de tecidos de camundongos Inner Ear usando Citometria de Fluxo

DOI:

10.3791/3432

⸱

23 de dezembro de 2011

 ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Stanford University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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A citometria de fluxo é uma ferramenta poderosa que permite o isolamento e o estudo de populações de células específicas. Este protocolo descreve as etapas para isolar células que expressam LacZ de tecidos cocleares de camundongos transgênicos neonatais. As células cocleares dissociadas foram marcadas usando substratos conjugados fluorescentes de β-galactosidase antes da separação por citometria de fluxo.

Resumo

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O isolamento de tipos específicos de células permite analisar populações de células raras, como células-tronco/progenitoras. Essa abordagem para estudar os tecidos do ouvido interno apresenta um desafio único devido à escassez de células de interesse e poucos modelos de camundongos repórteres transgênicos. Aqui, descrevemos um protocolo usando sondas conjugadas com fluorescência para marcar seletivamente células LacZ-positivas da cóclea neonatal.

A patologia subjacente mais comum da perda auditiva neurossensorial é o dano irreversível e a perda das células ciliadas sensoriais da cóclea, que são necessárias para transduzir ondas sonoras em impulsos neurais. Evidências recentes sugerem que os órgãos auditivos e vestibulares murinos abrigam células-tronco/progenitoras que podem ter potencial regenerativo1,2. Esses achados justificam uma investigação mais aprofundada, incluindo a identificação de tipos específicos de células com características de células-tronco/progenitoras. A via de sinalização Wnt demonstrou desempenhar um papel crítico na manutenção de populações de células-tronco / progenitoras em vários sistemasde órgãos 3-7. Recentemente, identificamos células que expressam Axin2 responsivas a Wnt na cóclea neonatal, mas sua função é amplamente desconhecida8.

Para entender melhor o comportamento dessas células responsivas a Wnt in vitro, desenvolvemos um método de isolamento de células que expressam Axin2 da cóclea de camundongos repórteres Axin2-LacZ9. Usando citometria de fluxo para isolar células positivas para Axin2-LacZ da cóclea neonatal, poderíamos, por sua vez, executar uma variedade de experimentos em células vivas para interrogar seu comportamento como células-tronco / progenitoras. Aqui, descrevemos em detalhes as etapas para a microdissecção da cóclea neonatal, dissociação desses tecidos, marcação das células LacZ-positivas usando um substrato fluorogênico e classificação celular. Técnicas para dissociar cócleas em células únicas e isolar células cocleares por citometria de fluxo têm sido descritas2,10-12. Fizemos modificações nessas técnicas para estabelecer um novo protocolo para isolar células que expressam LacZ da cóclea neonatal.

Protocolo

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1. Microdissecção da cóclea

  1. Prepare o microscópio de dissecção sob o capô, limpando as superfícies com etanol a 70% e colocando blocos de gelo.
  2. Prepare 10-15 placas de Petri de 35 mm em condições estéreis e encha até a metade (~ 2 ml) com solução salina balanceada de Hank estéril com cálcio (HBSS).
  3. Prepare duas placas de Petri de 35 mm em condições estéreis e encha até a metade (~ 2 ml) com solução estéril 1x tamponada com fosfato (PBS).
  4. Esterilize micropinças em tubo Falcon cônico de 50 ml com etanol a 70%.
  5. Em uma sala separada do capuz estéril, use uma tesoura de íris para decapitar camundongos repórter Axin2L....

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Discussão

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Pesquisas independentes caracterizaram capacidade regenerativa limitada dentro da cóclea neonatal2,10,12,13. Usando camundongos repórter GFP e citometria de fluxo, White e colegas isolaram células de suporte cocleares específicas e descobriram que elas tinham características de células progenitoras12.

A via Wnt canônica demonstrou marcar populações de células-tronco/progenitoras em vários sistemas de órgãos, incluindo cérebro, glândula mamária, sistema hematopoiético, pel.......

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

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Agradecemos a S. Heller, K. Oshima, R. Nusse e Y. Zeng pelas discussões frutíferas e a C. Tang, A. Lee, E. Liaw e à equipe do Stanford Shared FACS Facility pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela Howard Hughes Medical Institute Medical Research Training Fellowship, pelo programa Stanford University Medical Scholars (ambos para TAG), Stanford University Dean's Fellowship (para RC), American Otological Society, Triological Society, Percy Memorial Award, Akiko Yamazaki e Jerry Yang Faculty Scholar Fund e NIDCD / NIH K08 DC011043 (todos para AGC).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de Petri, poliestireno, estéril Geriner Bio-one 35 x 10 mm

VWR international82050-540

BD Filtros de Células Falcon, Estéril, BD Biosciences, azul, 40 μ m

VWR internacional21008-949

Hanks' Solução salina balanceada (HBSS). Solução com Cálcio, Magnésio e sem Vermelho de Fenol, Estéril

VWR international45000-456

Tubos de centrífuga Cellstar, polipropileno, estéreis, greiner bio-one, 50 ml

VWR international82050-346

Cellstar tubos de centrífuga, polipropileno, estéreis, greiner bio-one, 15 ml

VWR international82050-278

B-27 Suplemento sem soro (50x), líquido

Invitrogen17504-044

N-2 Suplemento (100x), líquido

Invitrogen17502-048

bFGF, fator de crescimento de fibroblastos-humano básico

Sigma-AldrichF0291

IGF-1, fator de crescimento semelhante à insulina-1 de camundongo

Sigma-AldrichI8779

EGF, fator de crescimento epidérmico humano

Sigma-AldrichE9644

Dulbecco' s Águia Modificada' s Médio/Presunto' s F-12 50/50 Mix: 1X, com L-Glutamina e 15 mM HEPES

VWR international45000-350

BD Falcon Tubos de fundo redondo, descartáveis, poliestireno, 12x75

VWR international60819-295

Tripsina, 0,25% (1X) com EDTA 4Na, líquido

Invitrogen25200-056

ep Dualfilter TIPS 300uL, 960 TIPS

Eppendorf22491245

tripsina, Soja, Purificado

Worthington BiochemicalLS003570

BD Falcon 40um Cell Strainers

BD Biosciences21008-949

Placas multipoços, poliestireno, Greiner Bio-One, Placas não tratadas, 6 poços

VWR international82050-846

Marker Gene FACS Blue LacZ beta-Galactosidase Detection Kit

Marker Gene TechnologiesM0255

Inibidor de

Referências

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  1. Li, H., Liu, H., Heller, S. Pluripotent stem cells from the adult mouse inner ear. Nat. Med.. 9, 1293-1299 (2003).
  2. Oshima, K. Differential distribution of stem cells in the auditory and vestibular organs of the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol

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LacZ expressing CellsFlow CytometryMouse Inner EarCochlear Tissue IsolationTissue DissociationCell SortingFluorescent LabelingPropidium Iodide StainingAxin2 LacZ ReporterNeonatal Cochlea

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