A citometria de fluxo é uma ferramenta poderosa que permite o isolamento e o estudo de populações celulares específicas. Este protocolo descreve os passos para o isolamento de células que expressam LacZ a partir de tecidos cocleares de camundongos transgênicos neonatos. Células cocleares dissociadas foram marcadas usando substratos conjugados com fluoróforo da β-galactosidase antes da separação por citometria de fluxo.
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Artigo de método
Isolando-LacZ expressar Células de tecidos de camundongos Inner Ear usando Citometria de Fluxo
Neste artigo
Resumo
Resumo
O isolamento de tipos celulares específicos permite analisar populações celulares raras, como células-tronco/progenitoras. Essa abordagem para o estudo dos tecidos da orelha interna apresenta um desafio único devido à escassez de células de interesse e ao pequeno número de modelos de camundongos transgênicos com repórter. Aqui, descrevemos um protocolo que utiliza sondas conjugadas com fluorescência para rotular seletivamente células positivas para LacZ provenientes da cóclea neonatal.
A patologia mais comum subjacente à perda auditiva neurossensorial é o dano irreversível e a perda de células ciliadas sensoriais cocleares, que são necessárias para transduzir ondas sonoras em impulsos neurais. Evidências recentes sugerem que os órgãos auditivo e vestibular de camundongos abrigam células-tronco ou progenitoras que podem ter potencial regenerativo1,2. Essas descobertas justificam investigações adicionais, incluindo a identificação de tipos celulares específicos com características de células-tronco ou progenitoras. Demonstrou-se que a via de sinalização Wnt desempenha um papel crítico na manutenção de populações de células-tronco ou progenitoras em diversos sistemas orgânicos3-7. Recentemente, identificamos células que expressam Axin2 e respondem ao sinal Wnt na cóclea neonatal, mas sua função é amplamente desconhecida8.
Para compreender melhor o comportamento dessas células responsivas à Wnt in vitro, desenvolvemos um método para isolar células que expressam Axin2 de cócleas de camundongos repórter Axin2-LacZ9. Utilizando citometria de fluxo para isolar células Axin2-LacZ positivas de cócleas neonatais, poderíamos então realizar uma variedade de experimentos com células vivas para investigar seu comportamento como células-tronco/progenitoras. Aqui, descrevemos em detalhes os passos para a microdissecação da cóclea neonatal, dissociação desses tecidos, marcação das células LacZ-positivas utilizando um substrato fluorogênico e separação celular. Técnicas para dissociação de cócleas em células individuais e isolamento de células cocleares por citometria de fluxo já foram descritas2,10-12. Realizamos modificações nessas técnicas para estabelecer um protocolo inédito para isolar células que expressam LacZ da cóclea neonatal.
Protocolo
1. Microdissecação da cóclea
- Prepare o microscópio de dissecação sob capela, limpando as superfícies com etanol 70% e colocando blocos de gelo.
- Prepare 10-15 placas de Petri de 35 mm em condições estéreis e preencha-as até metade (~2 ml) com solução salina equilibrada de Hank com cálcio (HBSS) estéril.
- Prepare duas placas de Petri de 35 mm em condições estéreis e preencha-as até metade (~2 ml) com solução tampão fosfato 1x estéril (PBS).
- Esterilize a pinça microcirúrgica em tubo cônico Falcon de 50 ml com etanol 70%.
- Em uma sala separada da capela estéril, use tesoura de íris para decapitar 12-15 camundongos repórter Axin2LacZ/+ pós-natais (P) com 0-3 dias de idade e coloque as cabeças em uma placa de Petri de 60 mm sobre um bloco de gelo.
- Usando pinça #5 Dumont e tesoura de íris, remova a mandíbula e a língua e corte a base do crânio ao nível do palato.
- Remova a pele sobrejacente da calvária e seccione a base do crânio inserindo a tesoura na parte inferior do forame magno até o meio do palato.
- Realize outro corte com a tesoura de íris desde a borda cortada do palato até a face superior da calvária em ambos os lados, tomando cuidado para não danificar a cápsula ótica.
- Complete o isolamento do osso temporal realizando dois cortes angulados a 45 graus, começando da face superior do forame magno até o corte coronal no palato duro.
- Coloque os ossos temporais isolados em placas de Petri de 35 mm contendo HBSS sobre bloco de gelo.
- Colete ossos temporais de aproximadamente 12-15 animais sacrificados, totalizando 24-30 ossos temporais.
- Transfira a placa de Petri com os ossos temporais isolados para a capela de dissecação estéril previamente preparada (1.1).
- Transfira quatro ossos temporais para cada placa de Petri de 35 mm previamente preparada contendo HBSS (1.2) e coloque sobre bloco de gelo.
- Inicie a microdissecação usando duas pinças #55 para remover suavemente o córtex, o bulbo e o cerebelo no osso temporal sobrejacente à cápsula ótica.
- Sem remover a cápsula ótica, retire partes da cápsula coclear começando pela entrada do nervo vestibulococlear na cápsula ótica.
- Após expor a base da cóclea, puxe suavemente a cóclea e os tecidos circundantes. Remova qualquer gânglio espiral remanescente e a estria vascular começando pela base.
- Transfira a cóclea para uma placa de Petri de 35 mm contendo PBS sobre bloco de gelo.
- Para viabilidade tecidual ideal, o tempo total de dissecação deve ser inferior a 60 minutos.
- Repita os passos acima para 3-5 camundongos selvagens (WT) P0-P3 como controles para os camundongos Axin2-LacZ.
2. Dissociação celular (modificado de métodos previamente descritos)2,10
- Coloque 50 μl de PBS estéril no centro de um poço em uma placa de cultura de 6 poços não revestida.
- Transfira até 20 cócleas Axin2LacZ/+ para cada gota de 50 μl de PBS. Uma nova gota de 50 μl de PBS deve ser usada para mais de 20 cócleas.
- Pré-aqueça alíquotas de 50 μl de tripsina a 0,125% por cerca de 2 minutos em banho-maria a 37°C.
- Adicione 50 μl de tripsina pré-aquecida a 0,125% ao PBS contendo as cócleas.
- Coloque a placa de 6 poços a 37°C por 8 minutos, tomando cuidado para não agitar a placa.
- Para interromper a tripsinização, adicione 50 μl de inibidor de tripsina de soja a cada gota de 100 μl.
- Adicione um volume adicional de 50 μl de Meio Completo (MC) (IGF-1, EGF, bFGF, HS, ampicilina em DMEM/F12)2.
- Usando uma ponteira larga de 300 μl e um micropipetador p200 ajustado em 125 μl, pipete suavemente as células 80 vezes, tomando cuidado para não formar bolhas.
- Após a trituração de cada gota, adicione um volume adicional de 200 μl de MC a cada poço.
- Passe as células através de um filtro celular azul Falcon de 40 μm para um novo poço.
- Transfira as células para tubos FACS Falcon padrão (aproximadamente 300 μl permanecem após trituração e filtração).
- Divida as células provenientes de cócleas selvagens em três tubos, diluindo 100 μl com 300 μl de MC em cada tubo. Um tubo será usado como controle em branco, outro será corado apenas com iodeto de propídio (PI, 1 μg/ml) (sem adição nesta etapa), enquanto o último será corado com 3-carboxiumbelil β-D-galactopiranosídeo (CUG, ver 2.15) para detectar fluorescência de fundo.
- Coloque 400 μl de células dissociadas provenientes de cócleas Axin2-LacZ em cada tubo FACS. Como controle com CUG apenas, dilua 10 μl de células em 390 μl de MC (ver tubo F na etapa 2.15). Ajuste o volume dos demais tubos para 400 μl.
- Incube as células em incubadora úmida a 37°C por 10 minutos.
- Prepare a solução de CUG:
- Prepare 200 μl de CUG para cada tubo FACS que necessitar coloração.
- Dilua o CUG em MC na proporção de 1:50 em capela escura, com exposição mínima à luz.
- Pré-aqueça o CUG diluído a 37°C por 3 a 5 minutos.
- Em seguida, adicione 200 μl de CUG diluído a cada tubo FACS apropriado. Para tubos não designados para receber CUG, adicione apenas MC (ver 2.15).
- Neste ponto, devem existir cinco categorias de tubos com os seguintes conteúdos (não adicione PI nesta etapa):
- Selvagem – sem CUG ou PI (para compensação, ver etapa 3.5-6)
- Selvagem – com PI apenas (para compensação)
- Selvagem – com CUG e PI (para controle contra células Axin2-LacZ)
- Axin2-LacZ – com CUG apenas (para compensação)
- Axin2-LacZ – com CUG e PI (para separação celular real)
- Axin2-LacZ – com CUG e PI (para análise de eventos)
- Proteja todos os tubos da luz e incube-os em incubadora úmida a 37°C por 25 minutos.
- Prepare solução fresca de HEPES + Soro Fetal Bovino (FBS) para interromper a reação após a incubação:
- Dilua 400 μl de FBS recentemente descongelado em 10 ml de HEPES estéril 10 mM (em PBS) em um tubo Falcon de 15 ml.
- Coloque o tubo no gelo até a conclusão da etapa 2.16.
- Adicione 1,8 ml de solução de HEPES gelada a cada tubo FACS em capela estéril com as luzes apagadas para minimizar a exposição à luz.
- Centrifugue as células a 1200 rpm por 5 minutos.
- Remova o sobrenadante e re-suspenda as células em 300 μl de MC, reunindo todas as alíquotas para a amostra de separação (Axin2-LacZ corada com CUG e PI).
- Adicione PI a cada tubo para atingir uma concentração final de 1 μg/ml.
- Coloque as células no gelo e proteja-as da luz.
3. Citometria de Fluxo
- Utilizamos um BD Aria II equipado com lasers de 488 nm, 633 nm e 407 nm. A detecção de CUG foi realizada utilizando o laser violeta de 407 nm e a PI utilizando o laser azul de 488 nm na Stanford Shared FACS Facility.
- É necessário um operador treinado de citômetro de fluxo. Prossiga para o próximo passo após aquecer os lasers, calibrar os detectores do citômetro seguindo as instruções do fabricante e definir os parâmetros ideais de separação. Em nossa experiência, verificamos que o uso de um bico de 100 μm otimiza a viabilidade celular para experimentos subsequentes.
- Os seguintes parâmetros foram utilizados: limiar em 5.000 eventos, taxa de fluxo inferior a 3.000 eventos/segundo, dispersão frontal (FSC) em 125 volts e dispersão lateral (SSC) em 250 volts; o canal PE-Cy5 foi usado para PI e o Cascade Blue para CUG.
- Enxágue a câmara do citômetro com etanol 70% e PBS, duas vezes cada, nesta ordem.
- Inicie a análise com células selvagens não coradas (tubo A no Passo 2.15). Colete 1.000 eventos para determinar a distribuição celular no gráfico de FSC versus SSC. Se a dispersão não for desejada, ajuste os parâmetros de FSC e SSC.
- Realize a compensação utilizando células WT não coradas (tubo A), WT coradas com PI (tubo B) e Axin2-LacZ coradas com CUG (tubo D). A compensação permitirá uma discriminação mais precisa dos sinais entre os diferentes comprimentos de onda dos lasers.
- Inicie a análise com células selvagens coradas com PI e CUG (tubo C) e defina os parâmetros de seleção para:
- Exclusão de detritos com base no gráfico de FSC versus SSC.
- Exclusão de dupletos e agregados utilizando o gráfico de FSC-altura versus FSC-área.
- Exclusão de células mortas com base no gráfico de FSC-área versus PE-Cy5-área.
- Configure o gráfico de FSC-área versus Cascade Blue-área com qualquer posicionamento de porta (gate).
- Em seguida, analise 10.000 eventos do tubo da amostra de separação que contém células Axin2-LacZ coradas com PI e CUG (tubo F).
- Todas as portas (gates) definidas utilizando células selvagens devem ser aplicadas aqui.
- Utilizando os gráficos das células selvagens, crie portas para células Cascade Blue-alto que representem menos de 1% do número total de eventos.
- Essa mesma porta de Cascade Blue-alto agora abrange aproximadamente 15-20% das células na amostra Axin2-LacZ, identificando-as como células Axin2-alto.
- Utilizando o gráfico de análise das células Axin2-LacZ, crie uma porta para os 15-20% menos fluorogênicos das células, doravante denominadas células Axin2-baixo.
- Com base na estratégia de seleção acima mencionada, separe as células em tubos FACS contendo 500 μl de FM, um tubo para células Axin2-alto e outro para células Axin2-baixo. Certifique-se de que os tubos de coleta estejam em uma câmara refrigerada a 4°C durante a separação.
- Registre o número de células contadas pelo citômetro de fluxo para cada população.
4. Resultados Representativos (ver Figura 2):
Com o protocolo descrito acima, normalmente recuperamos de 40 a 45% de células livres de detritos tanto das cócleas selvagens quanto das Axin2LacZ/+ (Figuras 2A e B), com cerca de 70% delas livres de dupletos (ver Figuras 2A' e B'). A maioria das células classificadas é viável e não incorporou PI (~95%) (Figuras 2A'' e B''). Em média, os ~20% superiores de células positivas para CUG são consideradas células positivas para Axin2-LacZ (Figura 2B''') e correspondem a cerca de 15.000 células com alto nível de Axin2-LacZ por 10 a 12 animais.
A análise de reordenação por citometria de fluxo de células Axin2-alta revelou pureza superior a 93% no canal Cascade Blue. Para confirmar ainda mais a identidade dessas células, realizamos imunomarcação pós-ordenação de células Axin2-alta e Axin2-baixa utilizando anticorpos anti-β-galactosidase, e observamos que as células Axin2-alta continham cerca de 93,4% de células positivas para β-galactosidase (mais de 1.500 células analisadas), enquanto as células Axin2-baixa continham cerca de 4,8% de células positivas para β-galactosidase.
Figuras e Tabelas:
Figura 1. Paradigma experimental. A figura acima ilustra a estratégia e as técnicas experimentais gerais conforme descritas na seção do protocolo. Cócleas de camundongos selvagens e Axin2LacZ/+ são coletadas e dissociadas em células individuais, que posteriormente são tratadas com CUG, um substrato fluorescente para β-galactosidase. Células com alto e baixo sinal de Axin2-LacZ são então separadas por meio de citometria de fluxo. Clique aqui para visualizar uma versão em tamanho ampliado desta imagem.
Figura 2. Estratégias de seleção (gating). Esta figura ilustra as estratégias de seleção utilizadas na citometria de fluxo. A) Células selvagens dissociadas que passaram pelo mesmo tratamento que as células Axin2-LacZ são analisadas aqui utilizando um total de 10.000 eventos. O primeiro painel demonstra a área de dispersão lateral (SSC-A) versus a área de dispersão frontal (FSC-A). Aqui, um grupo distinto de eventos apresenta tamanho muito maior do que os eventos mais próximos ao eixo y. Esses eventos são designados como "Negativo para detritos". A próxima seleção, A', analisa as células "Negativas para detritos" do painel A, que correspondem a 43,8% do número total de eventos (ver tabela abaixo). Neste painel, a altura de dispersão frontal (FSC-H) versus FSC-A é utilizada para excluir dupletos. Eventos que se desviam do comportamento linear esperado no gráfico são excluídos. Esta preparação normalmente resulta em cerca de 70% dos eventos dentro da seleção definida, sendo as células restantes excluídas. No painel A'', o iodeto de propídio (PI), detectado pelo canal PE-Cy5, é usado para marcar células mortas (5,3%). No painel seguinte (A'''), o canal Cascade blue é usado para detectar o substrato fluorescente CUG. Neste caso, as seleções LacZ-alto incluem menos de 1% do total de eventos. B) Células dissociadas de camundongos Axin2-LacZ tratadas com CUG e PI são analisadas aqui utilizando um total de 10.000 eventos. As mesmas seleções do painel A são aplicadas. B' mostra que 29,5% das células são excluídas como dupletos, enquanto B'' demonstra que 5,4% não são viáveis. As seleções iniciais para células LacZ-alto e LacZ-baixo são definidas usando o painel B''', com LacZ-alto inicialmente ajustado em 19,7% e LacZ-baixo em 20,4%. Clique aqui para visualizar uma versão em tamanho real desta imagem.
| Número de eventos | Porcentagem | ||
| A | Análise de tipo selvagem | 10,000 | |
| A' | Negativo para detritos | 4,381 | 43,80% |
| A'' | Negativo para dupletos | 3,116 | 71,10% |
| A''' | Negativo para PI | 2,951 | 94,70% |
| LacZ-alto | 16 | 0,54% | |
| LacZ-baixo | 2,790 | 94,50% | |
| B | Análise Axin2-LacZ | 10,000 | |
| B' | Negativo para detritos | 4,218 | 42,2% |
| B'' | Negativo para dupletos | 2,973 | 70,50% |
| B''' | Negativo para PI | 2,813 | 94,6% |
| LacZ-alto | 553 | 19,70% | |
| LacZ-baixo | 573 | 20,40% |
Tabela 1. Análises quantitativas das estratégias de seleção apresentadas na Figura 2.
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Discussão
Estudos de pesquisa independentes caracterizaram a capacidade regenerativa limitada nos cócleas neonatais2,10,12,13. Utilizando camundongos com marcador GFP e citometria de fluxo, White e colegas isolaram células de suporte cocleares específicas e descobriram que elas possuem características de células progenitoras12.
Demonstrou-se que a via canônica do Wnt marca populações de células-tronco/progenitoras em múltiplos sistemas orgânicos, incluindo o cérebro, a glândula mam...
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Divulgações
Nenhum conflito de interesses declarado.
Agradecimentos
Agradecemos a S. Heller, K. Oshima, R. Nusse e Y. Zeng pelas discussões produtivas, e a C. Tang, A. Lee, E. Liaw e à equipe da Stanford Shared FACS Facility pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela Howard Hughes Medical Institute Medical Research Training Fellowship, pelo programa Stanford University Medical Scholars (ambos para T.A.J.), pela Stanford University Dean's Fellowship (para R.C.), pela American Otological Society, pela Triological Society, pelo Percy Memorial Award, pelo Akiko Yamazaki and Jerry Yang Faculty Scholar Fund e pelo NIDCD/NIH K08 DC011043 (todos para A.G.C.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| placa de Petri, poliestireno, estéril Geriner Bio-one 35 x 10 mm | VWR international | 82050-540 | |
| BD Falcon Coador de Células, Estéril, BD Biosciences, azul, 40 μm | VWR international | 21008-949 | |
| Hanks’ Solução Salina Balanceada (HBSS). Solução com Cálcio, Magnésio e sem Vermelho de Fenol, Estéril | VWR international | 45000-456 | |
| Tubos de centrífuga Cellstar, polipropileno, estéreis, Greiner Bio-One, 50 ml | VWR international | 82050-346 | |
| Tubos de centrífuga Cellstar, polipropileno, estéreis, Greiner Bio-One, 15 ml | VWR international | 82050-278 | |
| Suplemento Livre de Soro B-27 (50x), líquido | Invitrogen | 17504-044 | |
| Suplemento N-2 (100x), líquido | Invitrogen | 17502-048 | |
| bFGF, fator de crescimento de fibroblastos básico humano | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| IGF-1, fator de crescimento semelhante à insulina-1 de camundongo | Sigma-Aldrich | I8779 | |
| EGF, fator de crescimento epidérmico humano | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Dulbecco’s Eagle Modificado’s Meio/Ham’s F-12 50/50 Mix: 1X, com L-Glutamina e 15 mM HEPES | VWR international | 45000-350 | |
| BD Falcon Tubos Cónicos de Fundo Redondo, Descartáveis, de Poliestireno, 12x75 | VWR international | 60819-295 | |
| Tripsina, 0,25% (1X) com EDTA 4Na, líquida | Invitrogen | 25200-056 | |
| ep Dualfilter TIPS 300uL, 960 TIPS | Eppendorf | 22491245 | |
| Inibidor de Tripsina, de Soja, Purificado | Worthington Biochemical | LS003570 | |
| BD Falcon filtros celulares de 40 μm | BD Biosciences | 21008-949 | |
| Placas Multipoços, Poliestireno, Greiner Bio-One, Placas não tratadas, 6 poços | VWR international | 82050-846 | |
| Kit de Detecção de Beta-Galactosidase LacZ para FACS Azul de Gene Marcador | Tecnologias de Genes Marcadores | M0255 |
Referências
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- Jaks, V. Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells. Nat. Genet. 40, 1291-1299 (2008).
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- Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 173-190 (2009).
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Reimpressões e permissões
