Doseamento do atividade da quinase de LRRK2 In vitro</em

Resumo

Leucina Quinase Repita Rico 2 é uma quinase de vários domínios de grande porte, mutações em que são a causa genética mais comum da doença de Parkinson. Análise da atividade da proteína quinase tem provado ser uma ferramenta crucial na compreensão da biologia e disfunção desta proteína. Neste artigo, In vitro Assaying da atividade da quinase de LRRK2 e uma seleção de seus mutantes é descrito, fornecendo um sistema experimental para analisar a fosforilação de substratos putativa e disfunção potencial de LRRK2 na doença.

Resumo

Leucina Quinase Repita Rico 2 (LRRK2) é um aminoácido 2527 membro da família ROCO de proteínas, possuindo um complexo, a estrutura de vários domínios, incluindo um domínio GTPase (denominado ROC, por Ras Complexo de proteínas) e um domínio quinase ^1. A descoberta em 2004 de mutações em LRRK2 que causam a doença de Parkinson (DP) resultou em LRRK2 sendo o foco de um grande volume de pesquisas sobre a sua função normal e como a proteína vai mal no estado de doença ^2,3. As investigações iniciais sobre a função do LRRK2 focada em suas atividades enzimáticas ^4-6. Embora uma imagem clara ainda a emergir de uma alteração consistente nestes devido a mutações, dados de um número de grupos destacou a importância da atividade da quinase de LRRK2 na morte da célula ligada a mutações ^7,8. Publicações recentes relataram inibidores visando a atividade da quinase de LRRK2, fornecendo uma ferramenta fundamental experimental ^9-11. À luz destes dados,É provável que as propriedades enzimáticas de LRRK2 nos proporcionar uma importante janela para a biologia desta proteína, embora se eles são alvos potenciais para drogas de Parkinson é aberto a debate.

Um número de diferentes abordagens têm sido usadas para ensaio da atividade da quinase de LRRK2. Inicialmente, os ensaios foram realizados com proteínas tag epítopo overexpressed em linhagens de células de mamíferos e immunoprecipitated, com os ensaios realizados utilizando essa proteína imobilizada em esferas de agarose ^4,5,7. Posteriormente, purificada fragmentos recombinantes de LRRK2 em solução também têm sido utilizados, por exemplo, um fragmento de GST tag purificada a partir de células de inseto contendo resíduos 970-2527 LRRK2 de ^12. Recentemente, Daniels et al. Relatado o isolamento de LRRK2 comprimento total em solução de células embrionárias do rim, porém esta proteína não é amplamente disponível ^13. Em contraste, a fusão GST truncado forma de LRRK2 é comercialmente available (a partir de Invitrogen, ver Tabela 1 para detalhes), e fornece uma ferramenta conveniente para demonstrar um ensaio para LRRK2 atividade da quinase. Várias saídas diferentes para LRRK2 atividade da quinase têm sido relatados. Autofosforilação de LRRK2 em si, a fosforilação da proteína básica da mielina (MBP) como substrato genérico quinase e fosforilação de um substrato artificial - LRRKtide apelidado, com base na fosforilação da treonina 558 em Moesin - foram todos utilizados, assim como uma série de supostas substratos fisiológicos incluindo α-sinucleína, Moesin e 4-EBP ^14-17. O status destas proteínas como substratos para LRRK2 ainda não está claro, e como tal o protocolo descrito a seguir incidirá sobre o uso do MBP como substrato genérico, destacando a utilidade deste sistema para ensaio de atividade quinase LRRK2 dirigido contra uma ampla gama de substratos em potencial.

Protocolo

Segurança

O protocolo descrito a seguir utiliza ATP marcado com P ³² radioativo na posição de fosfato γ seguir a atividade da quinase de LRRK2. É baseado em protocolos padrão utilizado em nosso laboratório, e assim em relação a muitas das etapas do processo, como corrida, os géis, western blotting et cetera os materiais e condições precisas deve ser tomado como um guia de como o equipamento e os protocolos utilizada para estes processos varia de laboratório para laboratório. Compostos contendo isótopos que emitem radiação ionizante são potencialmente prejudiciais para a saúde humana e licenciamento e regulamentos estritos em um controle de nível institucional e nacional o seu uso. Os experimentos deste protocolo foram realizados após o treinamento em uso de fonte aberta de radiação no University College London e seguir as orientações de boas práticas de laboratório fornecidos pelos serviços de segurança na faculdade (diretrizes available em http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ). Uso de radiação de código aberto não deve ser tentada antes da formação adequada e aprovação dos órgãos reguladores. A entidade reguladora responsável pela radiação de fonte aberta em pesquisas de laboratório varia de país para país. Exemplos destes são: no Reino Unido, o Health and Safety Executive ( http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm ), nos Estados Unidos, a Comissão Reguladora Nuclear ( http:// www.nrc.gov / materiais / miau / regs-guias-comm.html ), no Canadá, o Canadian Nuclear Safety Commission ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), e na Alemanha Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http : / / www.bfs.de / de / bfs ). Usuários de outros países devem confirmar regras, regulamentos e autoridades de licenciamento com seu oficial de segurança de radiação. Precauções de segurança relevantes para este protocolo foram anotados no texto, destacados com o símbolo do trevo radioativo ( ).

1. Preparando as reações quinase

Todas as misturas de reação preparado em tubos de amostra de 1,5 ml com tampa de rosca contendo um anel de vedação para impedir a propagação da radioatividade.

1. Proteína descongelar em gelo - LRRK2 tipo selvagem, D1994A, G2019S.
2. compõem reação no gelo - 10nM LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 5ul de tampão 10x quinase, composta de 50μl com água.

2. Execução do ensaio

Todos os passos utilizando ³² P ATP deve tomar prendas em áreas de radiação designado.

Equipamentos de protecção individual adequado deve ser usado - sob procedimento operacional padrão em nosso laboratório incluem jaleco, luvas e óculos de proteção dupla.

Amostras contendo ³² P ATP devem ser protegidos por telas de usuários 6 milímetros Perspex para minimizar a exposição.

Se for o caso, os dispositivos de monitoração pessoal devem ser utilizados - dentro UCL, qualquer usuário radiação open source certificadas devem ter um crachá filme para monitorar a exposição à radiação durante as experiências.

Todas as superfícies experimentais devem ser avaliados para a contaminação radioativa antes e após o uso utilizando um Geiger balcão.

Todos os consumíveis potencialmente contaminados devem ser eliminados de estrita observância às diretrizes institucionais para a eliminação de resíduos radioativos.

1. Antes de iniciar ensaio, definir blocos de aquecimento a 30 ° C e 100 ° C, respectivamente
2. Remover ³² P ATP de -20 freezer (note que as condições de armazenamento fro ³² P ATP pode variar dependendo do fornecedor ou tipo de radionucleotides utilizado). scan fora do recipiente antes de usar, descongele por trás da tela de acrílico.
3. Com as reações sobre o gelo, adicione 1μl de ³² P ATP para cada juntamente com 10μM de frio ATP.
4. Misture bem com uma pipeta. Centrífuga de pulso para levar líquidos para baixo do tubo, minimizando o risco de contaminação.
5. Remover alíquota de 15μl zero vírgula um tempod terminar reação na alíquota através da adição de 5μl de tampão de amostra SDS 4x e desnaturação a 100 ° C por 10 minutos. Centrífuga de pulso para levar líquidos para baixo do tubo, minimizando o risco de contaminação.
6. Amostra restante colocado em bloco de aquecimento e incubados a 30 ° C por 60 minutos.
7. 15μl removido em 60 minutos e ponto de tempo de reação interrompida pela adição de 5μl de tampão de amostra SDS 4x e desnaturação a 100 ° C por 10 minutos. Centrífuga de pulso para levar líquidos para baixo do tubo, minimizando o risco de contaminação.

3. Immunoblotting das amostras e análise de resultados

1. Amostras executado em SDS-PAGE
   1. 10 também em gel de poliacrilamida 4-12% Bis-tris preparado para eletroforese usando tampão de corrida MOPS.
   2. 20μl de cada amostra carregado em gel junto com farelos de 7μlTain escada proteína padrão.
   3. Gel funcionar em 160V por 90 minutos, ou até frente de corante atingiu o final do gel. Todo o líquido em contato com radioisótopos devem ser tratados como resíduos radioactivos e eliminados de acordo com as diretrizes institucionais. UCL regulamentações estatais que os resíduos radioativos líquidos devem ser descartados derramando abaixo designados sumidouros disposição radioativo com água abundante.
2. Proteínas de membrana PVDF transferido para via western blot.
   1. Buffer de transferência preparado, 1x Tris Glycine além de metanol 20%. PVDF membrana e papel filtro de corte para corrigir tamanho para gel e ativada com metanol glacial no caso da membrana ou pré-molhada com buffer de transferência no caso do papel de filtro. A membrana deve ser pré-marcados com tinta esferográfica para permitir a identificação da orientação. Gel removido plastic revestimento e excesso de acrilamida removidos e eliminados como resíduos radioactivos.
   2. O gel deve ser formado em um sanduíche com a membrana e papel de filtro, garantindo que não existem bolhas entre a membrana eo gel, e depois organizados no aparelho de western blot com a membrana entre o gel eo ânodo.
   3. Transferência realizada em 25V por 16 horas.
3. Após a transferência de proteína para PVDF, a membrana devem ser secas à temperatura ambiente. Finalmente, a membrana seca devem ser isolados entre as folhas de acetato de celulose e expostos a qualquer uma tela de fósforo ou x-ray filme para permitir a detecção de proteínas marcado radioactivamente. Tempo de exposição pode ser executado a partir de várias horas para mais de uma semana, dependendo da atividade específica do radioisótopo usado ea cinética enzimática da reação.
4. Phosphoscreen digitalizadas / filme processado. Se estiver usando uma tela de fósforo, a imagem deve ser salva como um TIFF de alta resolução ou arquivos bitmap, se estiver usando filme, então a transição resultantesparency devem ser verificados usando um scanner de mesa e salvo como um TIFF de alta resolução ou arquivos bitmap. A imagem pode então ser analisada em ImageJ, um programa freeware disponível no site da National Institutes of Health ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).

4. Resultados representante

A Figura 1 mostra resultados representativos para um ensaio realizado com o tipo selvagem, e G2019S D1994A LRRK2 com proteína básica da mielina como substrato aceitador de fosfato de genéricos. Autofosforilação de LRRK2 é visível em ≈ 200kDa, com várias bandas que representam MBP fosforilada visível a partir de 20 40kDa. Observe a ausência de autofosforilação na pista D1994A (quinase mortos), e aumento da fosforilação devido à mutação G2019S. Nota fosforilação também residual de MBP na pista quinase mortos. Isto pode ser devido à ablação incompleta da atividade da quinase de LRRK2 pelo mutante D1994A ou refletir a presença of trace contaminando quinases na reação.

Figura 1.

Discussão

Este artigo descreve um protocolo básico para ensaio de atividade da quinase de LRRK2 usando um sistema in vitro. No interesse da brevidade, esta tem sido limitada a um modelo de ponto final de uma hora utilizando um substrato genérico, mas o protocolo geral é aplicável a uma gama de substratos potenciais e passíveis de análises mais sofisticadas examinar a cinética da atividade de quinase de LRRK2 . Isso destaca uma das principais vantagens da utilização de um sistema in vitro para analisar o comportamento de uma proteína quinase como esta: porque não há controle total sobre as concentrações da enzima e do substrato, é possível gerar dados cinéticos K _m e calcular e V _max para a reação. Para informações mais detalhadas avaliações cinética ou avaliar o impacto dos inibidores putativos, um sistema de maior rendimento (como o que é garantida pela utilização do substrato LRRKtide, disponível a partir Invitrogen) é uma alternati superioresve para a abordagem descrita aqui.

É importante, no entanto, reconhecer que o sistema fornecido pelo modelo reducionista em ensaios in vitro quinase é apenas uma ferramenta para examinar a biologia de uma quinase e suas relações com substratos em potencial. Dados de ensaios como este deve ser usado em conjunto com outras abordagens para obter um quadro abrangente de como se comporta uma quinase in vitro e em um contexto celular. Por exemplo, um substrato putativo fosforilado in vitro podem ser analisados ​​por espectrometria de massa para identificar phosphosites possíveis que podem ser manipulados por mutagênese alvo (por exemplo, serina. Converter ou resíduos de fosfato de treonina aceitador a ninguém-fosforilável resíduos, tais como alanina) para examinar o funcional conseqüências do ex vivo fosforilação.

Uma consideração importante na interpretação dos dados a partir de um sistema de análise in vitro, como este é a probabilidade de either tipo I ou II (falso negativo ou falso positivo) erros. A natureza reducionista deste sistema, infelizmente, dispõe que para ambos - no caso do primeiro, tendo um substrato purificado e purificado putativo quinase em proximidade estreita artificialmente e em alta concentração (em comparação com o meio celular) pode resultar em eventos de fosforilação artefactual. Por outro lado, muitas quinases funcionam como parte de um complexo dentro do contexto da célula, e exigem co-fatores para a fosforilação de um determinado substrato para ocorrer. Como observado acima, um resultado positivo de fosforilação de um substrato utilizando um suposto sistema in vitro deve ser testado em um sistema celular para validar o resultado, e um resultado negativo devem ser interpretados com cautela.

Em vista disso, é fundamental sempre que possível ter os controles positivos e negativos para permitir um estudo comparativo da atividade quinase do seu interesse. A seleção cuidadosa de um contro positival que tem uma atividade conhecida para a sua proteína de interesse, juntamente com um controle negativo que é improvável que fosforilar o substrato putativo, é extremamente valioso. Um controle candidato para LRRK2 é Receptor interagindo quinase 3, que tem uma seqüência estreitamente relacionado primário para o domínio quinase de LRRK2, mas tem uma estrutura de domínio geral muito diferente ^{de 18 anos.} Este está disponível como proteína recombinante de Invitrogen e é usado como um controle padrão em nosso laboratório.

Também deve ser notado que a forma comercialmente disponível de LRRK2 falta o N-terminal da proteína e é marcado com glutationa-s-transferase e isso deve ser levado em consideração como um fator potencial de confusão na realização de ensaios com essa proteína quinase, como não se sabe qual o papel que o N-terminal de LRRK2 pode jogar na função normal da proteína. Se, por exemplo, a porção N-terminal de LRRK2 que está ausente na proteína utilizada neste protocoloé fundamental para o recrutamento de um substrato específico para o domínio da quinase LRRK2 então isso terá um impacto importante sobre a fosforilação observado de substrato disse no sistema in vitro descrito acima.

Mesmo com essas ressalvas, no entanto, a importância atribuída à biologia do LRRK2 na pesquisa de Parkinson destaca a utilidade deste protocolo como uma ferramenta valiosa para investigar o comportamento dessa proteína em uma configuração em vitro.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente	Companhia	Número Catálogo	Comentário
LRRK2 tipo selvagem	Invitrogen	PV4873
G2019S LRRK2	Invitrogen	PV4881
LRRK2 D1994A	Invitrogen	PV6051
Buffer de quinase	Sinalização celular	9802S
MBP	Sigma	M1891
32P g ATP	Perkin Elmer	BLU002X500UC	500μCi, 30Ci / mMole
Tampão de amostra 4x LDS	Invitrogen	NP0007
2-mercaptoetanol	Sigma	M6250
Padrões de proteína	Invitrogen	LC5800
Tampão de corrida MOPS	InvitrOgen	NP0001
Bis-tris gel de acrilamida	Invitrogen	NP0321	4-12% 1 milímetro 10well
PVDF membrana	Millipore	IPVH00010
Buffer de transferência	Invitrogen	NP0006

Tabela 1. Reagentes

Destilada e água desionizada foi utilizada para todas as etapas de diluição

Tipo de equipamento	Companhia	Comentário
Contador Geiger	Mini Instruments
SDS PAGE tanque	Invitrogen
Tanque de transferência	Invitrogen
Blocos de calor (2)	Eppendorf
Fósforo da tela	GE	X-ray filme pode ser substituído
Phosphor imager	GE
Cassete exposição	GE
Centrifugador	Eppendorf
Perspex blindagem
Tubos de 1,5 ml	VWR	Tampa de rosca com anel

Tabela 2. Equipamento