Uma maneira rápida de realizar imunocoloração do coração embrionário zebrafish é descrito. Em comparação com toda a abordagem montagem imunocoloração, este método aumenta drasticamente a penetração dos anticorpos, o que permite obter imagens de alta resolução que revelam estruturas celulares / subcelulares no coração dentro de um tempo de processamento muito reduzido.
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Artigo de método
Imunomarcação de Dissecada Coração Zebrafish embrionárias
Neste artigo
Resumo
Resumo
Embrião torna-se um popular paulistinha in vivo modelo de vertebrados para estudar o desenvolvimento de doenças cardíacas e coração humano, devido à sua embriologia e genética vantajoso 1,2. Cerca de 100-200 embriões estão prontamente disponíveis a cada semana a partir de um único par de peixes adultos. Os embriões que se desenvolvem transparente utero ex torná-los ideal para avaliar defeitos cardíacos 3. A expressão de qualquer gene pode ser manipulado através de morfolino tecnologia ou injeção de RNA 4. Além disso, a frente telas genética já gerou uma lista de mutantes que afetam diferentes perspectivas de cardiogenesis 5.
Imunocoloração montar todo é uma técnica importante neste modelo animal para revelar o padrão de expressão da proteína alvo de um tecido especial 6. No entanto, imagens de alta resolução que pode revelar estruturas celulares ou subcelulares têm sido difíceis, principalmente devido à locat físicaion do coração e da pouca penetração dos anticorpos.
Aqui, apresentamos um método para solucionar esses gargalos dissecando o coração primeiro e depois conduzir o processo de coloração na superfície de uma lâmina de microscópio. Para evitar a perda de amostras pequenas e coração para facilitar o manuseio solução, restringimos a amostra coração dentro de um círculo na superfície do microscópio slides puxado por uma caneta immEdge. Após a coloração, os sinais de fluorescência pode ser diretamente observado por um microscópio composto.
Nosso novo método melhora significativamente a penetração de anticorpos, uma vez que um coração de um peixe embrionárias só consiste de camadas de células. Imagens de alta qualidade a partir de corações intactos podem ser obtidos dentro de um prazo muito reduzido para a procissão de embriões zebrafish com idades entre dia 2 a dia 6. Nosso método pode ser potencialmente estendido a outros órgãos dissecados mancha de qualquer peixe-zebra ou outros pequenos animais.
Protocolo
1. Preparação de slides e câmara umidificado
- A câmara úmida pode ser feita de uma caixa, como uma caixa de ponta esvaziado. Enrole tanto a câmara ea tampa com papel alumínio para proteger as amostras da luz.
- Dentro da câmara, coloque uma pilha de toalhas de papel molhado para manter a umidade dentro da câmara, o que impedirá as amostras de coração de secagem. Definir uma microplaca pequena na parte superior da toalha de papel como um rack para os slides.
- Desenhe linhas ou círculos sobre a superfície de uma lâmina de microscópio usando a caneta immEdge para fazer poços para amostras coração com uma dimensão de 5x5 milímetros. Deixe os sl....
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Discussão
Em comparação com os métodos clássicos imunocoloração toda montagem, nosso método tem as seguintes vantagens. Em primeiro lugar, muito mais forte sinais fluorescentes podem ser obtidos de forma consistente, devido à penetração melhorada. Em todo o método de montagem de positividade, o tecido da pele densa que envolve o coração reduziu significativamente a penetração de muitos anticorpos, resultando em elevado ruído de fundo em todo o corpo. Este problema é especialmente grave para os embriões com mais de 3 dias pós-fert.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos a Beninio Jomok por sua ajuda na criação de peixe-zebra. Este trabalho é financiado pelo NIH HL81753.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| tricaina | Orgânicos de pesquisa | 3007T | |
| Formaldeído | Polysciences | 04018 | |
| Seringa de insulina | Becton Dickinson | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma | T8532 | |
| Anti-β-catenina anticorpo | Sigma | C7207 | |
| Anticorpos anti-Mef2c | Santa Cruz Biotech | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinina anticorpos | Sigma | A7811 | |
| Anti-anticorpo Ilk | Sinalização celular | # 3862 | |
| Alexa flúor 568 cabra anti IgG de coelho td> | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa flúor 488 cabra anti-rato IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Meio de montagem para fluorescência | Vetor | H-1200 | |
| ImmEdge caneta | Vetor | H-4000 | |
| Poli-L-lisina slides revestido | Microscopia eletrônica de ciências | 63410-01 | |
| Tampa de vidro de microscópio | Pescador | 12-543-D | |
| Concaved lâminas de microscópio | Pescador | 7-1305-8 | |
| Microscópio de dissecção | Leica MZ95 | ||
| Microscópio composto | Zeiss | Axioplan2 | |
| ApoTome | Zeiss |
PBST:
1 x PBS
0,5% Triton-X 100
400 mg tricaina
97,9 mL DDH 2 O
2,1 mL (1M Tris PH9)
Ajustar o pH para 7,0
Referências
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoe....
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Reimpressões e permissões
