Uma maneira rápida de realizar imunocoloração do coração embrionário zebrafish é descrito. Em comparação com toda a abordagem montagem imunocoloração, este método aumenta drasticamente a penetração dos anticorpos, o que permite obter imagens de alta resolução que revelam estruturas celulares / subcelulares no coração dentro de um tempo de processamento muito reduzido.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Imunomarcação de Dissecada Coração Zebrafish embrionárias
Neste artigo
Resumo
Resumo
Embrião torna-se um popular paulistinha in vivo modelo de vertebrados para estudar o desenvolvimento de doenças cardíacas e coração humano, devido à sua embriologia e genética vantajoso 1,2. Cerca de 100-200 embriões estão prontamente disponíveis a cada semana a partir de um único par de peixes adultos. Os embriões que se desenvolvem transparente utero ex torná-los ideal para avaliar defeitos cardíacos 3. A expressão de qualquer gene pode ser manipulado através de morfolino tecnologia ou injeção de RNA 4. Além disso, a frente telas genética já gerou uma lista de mutantes que afetam diferentes perspectivas de cardiogenesis 5.
Imunocoloração montar todo é uma técnica importante neste modelo animal para revelar o padrão de expressão da proteína alvo de um tecido especial 6. No entanto, imagens de alta resolução que pode revelar estruturas celulares ou subcelulares têm sido difíceis, principalmente devido à locat físicaion do coração e da pouca penetração dos anticorpos.
Aqui, apresentamos um método para solucionar esses gargalos dissecando o coração primeiro e depois conduzir o processo de coloração na superfície de uma lâmina de microscópio. Para evitar a perda de amostras pequenas e coração para facilitar o manuseio solução, restringimos a amostra coração dentro de um círculo na superfície do microscópio slides puxado por uma caneta immEdge. Após a coloração, os sinais de fluorescência pode ser diretamente observado por um microscópio composto.
Nosso novo método melhora significativamente a penetração de anticorpos, uma vez que um coração de um peixe embrionárias só consiste de camadas de células. Imagens de alta qualidade a partir de corações intactos podem ser obtidos dentro de um prazo muito reduzido para a procissão de embriões zebrafish com idades entre dia 2 a dia 6. Nosso método pode ser potencialmente estendido a outros órgãos dissecados mancha de qualquer peixe-zebra ou outros pequenos animais.
Protocolo
1. Preparação de slides e câmara umidificado
- A câmara úmida pode ser feita de uma caixa, como uma caixa de ponta esvaziado. Enrole tanto a câmara ea tampa com papel alumínio para proteger as amostras da luz.
- Dentro da câmara, coloque uma pilha de toalhas de papel molhado para manter a umidade dentro da câmara, o que impedirá as amostras de coração de secagem. Definir uma microplaca pequena na parte superior da toalha de papel como um rack para os slides.
- Desenhe linhas ou círculos sobre a superfície de uma lâmina de microscópio usando a caneta immEdge para fazer poços para amostras coração com uma dimensão de 5x5 milímetros. Deixe os slides seco.
- Coloque as lâminas na câmara umidificada e adicionar 50uL formaldeído frescos 4% em cada poço.
2. Dissecção do coração embrionário
- Anestesiar o embrião de peixe em água contendo ovos E3 7 tricaina 0,4% para cerca de 1 minuto até que o peixe parar o movimento do corpo, mas ainda têm coração normalespancamento.
- Coloque uma lâmina de microscópio côncava no palco de um microscópio de dissecção. Transferência dos embriões para o bem concaved.
- Ajuste a combinação de luz do microscópio de dissecação claramente revelam o coração. Dependendo da preferência pessoal, pode ser tanto de campo escuro ou DIC-como condição de luz polarizada.
- Limpe duas seringas de insulina com etanol 75%, depois seque.
- Ajustar o microscópio de dissecação para maior ampliação e foco no coração. 'Fixar' fisicamente um embrião através da inserção de uma ponta da agulha para a fronteira gema de somito perto da cabeça. Inserir outro perto da agulha para a região do coração e puxe o coração para fora rapidamente. Se o coração não é totalmente separado do embrião, cortar o tecido remanescente conectado entre o coração ea gema.
- Ajustar o microscópio para menor ampliação e foco no coração separados. Use uma pipetteman 10μl e defini-lo ao volume 1μl. Aplicar a ponta do pipetteman a qualquer empate ou toque nacoração amostra, de modo que o coração isolado será dentro ou junto à superfície da ponta.
- Mergulhe a ponta da pipeta na solução de formaldeído 4% em lâminas preparadas e comprimir o pistão da pipeta para libertar o coração para a solução. A tensão da superfície da água também ajuda a liberar o coração da ponta da pipeta para a solução. Coloque menos de 3 corações em cada poço.
3. Imunocoloração
- Fechar a câmara e colocá-lo em uma coqueteleira com um movimento de balanço suave. Fixar a amostra do coração por 20 minutos em temperatura ambiente.
- Limpe a água na parte de trás das lâminas e colocar os slides no palco de um microscópio de dissecção para a troca de tampão.
- Molhe a ponta de um pipetteman 10μl em uma região vazia em cada bem e manter a ponta na medida do possível a partir de amostras do coração. Tomar precauções para evitar o coração prender à ponta, já que os corações possam se mover com o fluxo de água quando a solução é arrastado para a ponta. Mudançaa localização da ponta, se necessário.
- Descarte a solução em um tecido e evitar a produção de todas as bolhas na ponta, pois a amostra coração é facilmente perdido na presença de bolhas de ar. Manter as amostras coração parcialmente seco por um curto período de tempo pode ajudar a manter o coração ligado ao slides.
- Adicionar 50μl PBST para cobrir a amostra coração e incubar na câmara umidificada em um movimento de balanço lento por 5 min. Repita o enxágüe mais uma vez. Após esta etapa, as amostras de coração pode ser armazenada na câmara úmida até 1 semana a 4 ° C.
- Bloco da amostra coração com soro de ovelha 10% em PBST por 1 hora em temperatura ambiente.
- Incubar a amostra coração com anticorpos primários, tais como a diluição de 1:200 β-catenina anticorpo e diluição de 1:200 mef2 anticorpo específico, em ovinos 10% de soro / PBST por 1 hora em temperatura ambiente.
- Lavar a amostra coração com PBST três vezes (5 min. Cada) em temperatura ambiente.
- Incubar a amostra com secundárioanticorpos, tais como a diluição de 1:1000 Alexa marcadas anti-rato e / ou anticorpos anti-coelho, em PBST para 0,5 horas.
- Lavar as amostras coração com PBST três vezes (5 min. Cada) em temperatura ambiente.
4. Imagem
- Remover PBST e adicionar 10 mL de médio de montagem para cada poço. Rocha da câmara durante alguns minutos até que a solução se torna claro.
- Remover a maior parte do meio de montagem e cobrir todos os poços em um slide com uma tampa de vidro de microscópio (24x50).
- Coração imagem peixes usando Zeiss Axioplan 2 microscópio equipado com ApoTome (Carl Zeiss).
5. Resultados representante
Um exemplo de uma imagem que revela membrana e núcleos de todos os cardiomiócitos zebrafish é mostrado na figura. 1. anticorpos mef2c e β-catenina foram usados em conjunto para mancha amostras coração dissecados de 52 embriões zebrafish hpf. Enquanto mef2c manchas anticorpo os núcleos de cardiomiócitos, β-cateninaanticorpo revela a borda de cada célula 10/08. Ajustando o estágio do microscópio composto, as imagens das amostras do coração pode ser ajustado para a mesma orientação, o que permitirá a observação de curvatura externa e curvatura interna no coração 11. O número de cardiomiócitos total, o tamanho das células de cardiomiócitos e circularidade pode ser medido.
Outro exemplo que revela a estrutura do sarcômero de um coração embrionário é mostrado na figura. 2. Realizamos imunocoloração usando F59, um anticorpo miosina, em um coração dissecado embrionárias. A rede miofibrila em um coração inteiro embrionárias podem ser claramente revelado no menor aumento, enquanto a banda estriada de filamento grosso pode ser revelado no maior ampliação (Figura 2) 6.
Figura 1. Imunocoloração de mef2 (vermelho) e β-catenina (verde) para mostrar os núcleos e outlines de cardiomiócitos no ventrículo zebrafish. Barra de escala = 10μm
Figura 2. Immnostaining de miosina para mostrar o filamento grosso em um ventrículo zebrafish em uma ou outra baixa ampliação (A) ou alta ampliação (B). Barra de escala = 10μm
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Em comparação com os métodos clássicos imunocoloração toda montagem, nosso método tem as seguintes vantagens. Em primeiro lugar, muito mais forte sinais fluorescentes podem ser obtidos de forma consistente, devido à penetração melhorada. Em todo o método de montagem de positividade, o tecido da pele densa que envolve o coração reduziu significativamente a penetração de muitos anticorpos, resultando em elevado ruído de fundo em todo o corpo. Este problema é especialmente grave para os embriões com mais de 3 dias pós-fert...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos a Beninio Jomok por sua ajuda na criação de peixe-zebra. Este trabalho é financiado pelo NIH HL81753.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| tricaina | Orgânicos de pesquisa | 3007T | |
| Formaldeído | Polysciences | 04018 | |
| Seringa de insulina | Becton Dickinson | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma | T8532 | |
| Anti-β-catenina anticorpo | Sigma | C7207 | |
| Anticorpos anti-Mef2c | Santa Cruz Biotech | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinina anticorpos | Sigma | A7811 | |
| Anti-anticorpo Ilk | Sinalização celular | # 3862 | |
| Alexa flúor 568 cabra anti IgG de coelho td> | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa flúor 488 cabra anti-rato IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Meio de montagem para fluorescência | Vetor | H-1200 | |
| ImmEdge caneta | Vetor | H-4000 | |
| Poli-L-lisina slides revestido | Microscopia eletrônica de ciências | 63410-01 | |
| Tampa de vidro de microscópio | Pescador | 12-543-D | |
| Concaved lâminas de microscópio | Pescador | 7-1305-8 | |
| Microscópio de dissecção | Leica MZ95 | ||
| Microscópio composto | Zeiss | Axioplan2 | |
| ApoTome | Zeiss |
PBST:
1 x PBS
0,5% Triton-X 100
400 mg tricaina
97,9 mL DDH 2 O
2,1 mL (1M Tris PH9)
Ajustar o pH para 7,0
Referências
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E. Muscle: the regulation of myogenesis. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. Cadherins and associated proteins. Vivo. 5, 505-513 (1991).
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
