Um sistema experimental para estudar Mecanotransdução em células do pulmão fetal

Resumo

Forças mecânicas desempenham um papel chave no desenvolvimento de pulmão e lesão pulmonar. Aqui, nós descrevemos um método para isolar roedores fetais de pulmão de células do tipo II epiteliais e fibroblastos e expô-los a estimulação mecânica utilizando um In vitro Sistema.

Resumo

Forças mecânicas geradas in utero pelos repetitivos movimentos como de respiração e pela distensão líquido são essenciais para o desenvolvimento do pulmão normal. Um componente-chave do desenvolvimento do pulmão é a diferenciação de células alveolares do tipo II epiteliais, a principal fonte de surfactante pulmonar. Estas células também participar na homeostase de fluido no lúmen alveolar, de defesa do hospedeiro, e reparação de lesão. Além disso, as células do pulmão distais do parênquima pode ser directamente exposta ao estiramento exagerada durante a ventilação mecânica após o nascimento. No entanto, os mecanismos precisos moleculares e celulares, através da qual as células do pulmão detectam estímulos mecânicos para influenciar o desenvolvimento do pulmão e para promover a lesão pulmonar não são completamente compreendidos. Aqui, nós proporcionar um método simples e de alta pureza para isolar células de tipo II e de fibroblastos a partir de pulmões de roedores fetais. Em seguida, nós descrevemos um sistema in vitro, A Unidade de Strain Flexcell, para proporcionar a estimulação mecânica para células fetais, simulando forças mecânicas emdesenvolvimento pulmonar fetal ou lesão pulmonar. Este sistema experimental fornece uma excelente ferramenta para investigar os mecanismos moleculares e celulares em células de pulmão de feto expostos a esticar. Usando essa abordagem, nosso laboratório identificou vários receptores e proteínas sinalizadoras que participam mecanotransdução no desenvolvimento do pulmão fetal e lesão pulmonar.

Protocolo

1. Revestimento de placas com ECM proteínas

1. Sob condições estéreis, misturar 120 ug de laminina com 12 ml de frio estéril 1X PBS por placa.
2. Tome Bioflex placas não tratadas e adicionar 2 ml da solução a cada poço (concentração final de laminina é 2 ug / cm ^2). Alternativamente, outras proteínas de ECM podem ser utilizados, tais como colagénio-1 [10 ug / cm ^2], fibronectina [5 ug / cm ^2], vitronectina [0,5 ug / cm ^2] ou elastina [10 ug / cm ^2]. A técnica de revestimento é semelhante ao que é descrito para a laminina-revestimento. Assegure-se os poços são completamente cobertas pela solução.

Discussão

Neste artigo, nós descrevemos um método para isolar as células fetais do tipo II epiteliais e fibroblastos e expô-los a estimulação mecânica usando o aparelho Strain Flexcell. Usámos esta técnica para avaliar a diferenciação de células epiteliais ^1,2 e para estudar receptor e vias de sinalização activados por estiramento ^3-9. Além disso, este método também pode ser usado para investigar as respostas das células induzidas por lesão mecânica ^10,11. O procedimento baseia-se a digestão do te.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	Sigma-Aldrich	D5648
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Colagenase 1	Sigma-Aldrich	C0130
Colagenase 1A	Sigma-Aldrich	C9891
Soro de galinha	Sigma-Aldrich	C5405
Copos de peneira	Sigma-Aldrich	CD1-1KT
Filtros de seringa	Fisher Scientific	09-754-25
Malha de náilon de 100 mícrons	Small Parts, Inc.	CMN-100-D
Malha de 30 mícrons	Small Parts, Inc.	CMN-30-D
Malha de 15 mícrons	Dynamic Aqua-Supply Ltd.	NTX15
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020
Colágeno-1	Collagen Biomed	PC0701
Fibronectina	Sigma-Aldrich	F1141
Vitronectina	Sigma-Aldrich	V-0132
Elastina	Sigma-Aldrich	E-6402
Placa Bioflex	Flexcell International	BF-3001U	Não revestida
Unidade de Tensão Flexcell	Flexcell International	FX-5000