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Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato

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DOI:

10.3791/3563

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22 de novembro de 2011

 , 
1Pathobiological Sciences, Louisiana State University

Neste artigo

Resumo

A preparação altamente purificada de células dendríticas pulmonares do rato é descrito. Ênfase específica é dada para o isolamento de um subconjunto de células dendríticas convencionais.

Resumo

Células pulmonares dendríticas (DC) desempenham um papel fundamental na detecção invadindo 1,2 patógenos, bem como no controle de respostas tolerogênico 3 no trato respiratório. Pelo menos três subconjuntos principais de células dendríticas pulmonares têm sido descritas em ratos: DC convencional (CDC) 4, plasmocitóide DC (PDC) 5 e IFN-produzindo assassino DC (IKDC) 6,7. O subconjunto do CDC é o subconjunto DC mais proeminentes no pulmão 8.

O marcador comum conhecida para identificar subgrupos DC CD11c é, um tipo que eu transmembrana integrina (β2), que também é expresso em monócitos, macrófagos, neutrófilos e algumas células B 9. Em alguns tecidos, usando CD11c como um marcador para identificar rato DC é válido, como no baço, onde a maioria das células CD11c + representa o subconjunto do CDC que expressa altos níveis do complexo principal de histocompatibilidade classe II (MHC-II). No entanto, o pulmão é um tecido mais heterogêneo, onde sesubconjuntos lado DC, há uma elevada percentagem de uma população de células distintas que expressa altos níveis de CD11c combate os baixos níveis de MHC-II. Com base na sua caracterização e principalmente em sua expressão de F4/80, um marcador de macrófagos do baço, o CD11c oi MHC-II eis população de células do pulmão foi identificado como macrófagos pulmonares 10 e, mais recentemente, como um precursor potencial DC 11.

Em contraste com o rato pDC, o estudo do papel específico do CDC na resposta imunológica pulmonar tem sido limitado devido à falta de um marcador específico que poderia ajudar no isolamento dessas células. Portanto, neste trabalho, descrevemos um procedimento para isolar altamente purificado do mouse pulmão CDC. O isolamento de subconjuntos pulmonar DC representa uma ferramenta muito útil para obter insights sobre a função destas células em resposta a patógenos respiratórios, bem como fatores ambientais que podem desencadear a resposta imune do hospedeiro no pulmão.

Protocolo

1. Perfusão pulmonar e suspensão única célula

  1. Euthanize o mouse com uma injeção intraperitoneal de cetamina / xilazina mistura anestésica (em mg / mouse ketamina 1.8, xilazina 0,19) e sangria pela veia femoral
  2. Expor a cavidade torácica, cortando e puxando para trás a pele externa do peritônio. Proceder à abertura do diafragma, cortando a caixa torácica para expor tanto o coração e os pulmões.
  3. Perfundir gentilmente os pulmões com uma seringa de 5 ml preenchido com EDTA-HBSS (1mM EDTA de cálcio / magnésio livre de HBSS). Conectar uma agulha G 25 e inserir a agulha para o ventrículo direito. Para evitar fugas durante a injeção, segura o tecido ao redor da agulha myocardiac usando uma pinça. Suavemente injectar a solução, mantendo uma pressão constante. Perfusão será a precisão do resultado da inflação do pulmão e uma mudança de cor de rosa / branco.
  4. Remover linfonodos drenantes para descartar qualquer possível contaminação a partir deste tecido.
  5. Coletartecido pulmonar, a transferência para uma placa de Petri sobre gelo, e pique em pedaços pequenos usando uma lâmina de barbear.
  6. Transferência de tecidos fundada em um tubo C gentleMACS contendo 5 ml / pulmão de solução de digestão da colagenase (colagenase tipo 1A 0,5 mg / ml, mais tipo IV de pâncreas bovino DNase 20 mg / ml em HBSS contendo 5% de FBS, 100 U / ml de penicilina e 100 mg / estreptomicina ml).
  7. Use o dissociator gentleMACS para obter uma suspensão única célula. Escolha o programa: m_lung_01. Incubar amostra a 37 ° C por 30 minutos. Agite tubo a cada 5 minutos para voltar a suspender fragmentos de tecido. Prosseguir com m_lung_02 programa.
  8. Transferência de amostra para um tubo cônico de 15 ml e centrifugar por 10 minutos a 335 x g a 4 ° C. Após esta etapa, manter todos os reagentes e centrifugação a 4 ° C para evitar a redução da viabilidade celular.
  9. Elimine o sobrenadante e lise restantes células vermelhas do sangue, adicionando 2 ml de tampão de lise ACK por 1 minuto à temperatura ambiente. Lavar as células com 13ml de BSA PBS/0.5% fria e centrifugação por 10 minutos a 335 x g a 4 ° C.
  10. Elimine o sobrenadante, ressuspender total de células em 5 ml de BSA PBS/0.5% fria e passe completo de 100 M malha de nylon.
  11. Determinar o número total de células usando corante de exclusão de tripan blue.

2. Isolamento magnético e CD11c + enriquecimento de células

  1. Centrífuga suspensão única célula por 10 minutos a 200 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
  2. Ressuspender pellet celular em 400 mL de tampão de separação (PBS, BSA 0,5%, e 2 mM de EDTA) por 10 8 células total. Bloco de anticorpos Fc mediada inespecíficos ligação usando anti-CD16/CD32 anticorpos (0.5μg / 10 6 células) por 30 minutos a 4 ° C.
  3. Lavar as células com 10 ml de tampão de separação fria e centrifugação por 10 minutos a 200 x g a 4 ° C. Ressuspender as células em 400 mL de tampão de separação.
  4. Adicione 100 ml de microesferas de CD11c por 10 8 células total. Misture bem e incubar por 15 minutos na geladeira (2-8 ° C).
  5. Lavar as células com 10 ml de tampão de separação fria e centrifugação por 10 minutos a 200 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
  6. Ressuspender o pellet celular em 3 ml de tampão de separação frio.
  7. Realizar separação magnética usando o separador autoMACS Pro TM, selecionando o posseld programa. Recolher a fração positiva (0,5 ml).

3. Células dendríticas convencional (CDC) de isolamento

  1. Incubar enriquecido CD11c suspensão de células positivas com anti-CD11c-PE Cy7 e anti-IA/IE (MHC-II)-FITC anticorpos durante 30 minutos a 4 ° C. Concentração otimizada de anticorpos é de 0,5 mg / 10 6 de células.
  2. Lavar as células com BSA PBS/0.5% fria e centrifugação por 10 minutos a 335 x g a 4 ° C. Ressuspender as células em 0,5 ml de BSA PBS/0.5% e passá-las através de uma malha de nylon 40 mM.
  3. Proceder àclassificar as células usando o classificador de células FACS Aria no modo de pureza. Adicione 100 ml de BSA PBS/0.5% para os tubos de coleta, a fim de evitar danos de células purificadas. Mantenha suas células, a uma temperatura de refrigeração em todo o processo de separação de células.

4. Protocolo alternativo para a obtenção de uma suspensão única célula e CD11c + enriquecimento de células

  1. Em substituição do dissociator gentleMACS, tecido pulmonar fundamentada a partir do passo 1.5 pode ser transferida para um tubo cônico de 15 ml contendo 5 ml de solução de colagenase por pulmão e incubar por 1 hora a 37 ° C. Vortex células a cada 15 minutos, a fim de ressuspender fragmentos de tecido. Perturbar o tecido, passando a amostra 6-8 vezes dentro e para fora através de uma seringa de 3 ml conectada a uma agulha G 20. Evite fazer bolhas durante o processo, caso contrário, a viabilidade celular será comprometida. Uma vez que a suspensão única célula é obtida, continue para o passo 1.8.
  2. Em substituição do TM AutoMACSPro separaçãotor, o isolamento magnético para o enriquecimento das células CD11c, também pode ser realizada pela passagem da suspensão de células manualmente através de duas colunas MACS. A seleção das colunas apropriado irá variar dependendo do tamanho da amostra.

5. Resultados representativos:

Pulmão CDC são identificados como CD11c oi / MHC-II população de células oi. Como mostrado na figura. 1, do CDC representam uma porcentagem menor de 1,4% quando comparado a alguns outros tecidos, como baço (4,8%). No entanto, em contraste com o baço, as células do pulmão CD11c positiva expressar diferentes quantidades de MHC-II, incluindo uma população de células diferentes do que a de CDC. Após a preparação de uma única célula, o rendimento das células pulmonar total foi de cerca de 3,0-3,8 x 10 7 células / pulmão com uma viabilidade de 60-70% dos quais pouco mais de 1%, representado subconjunto CDC. Esta percentagem foi aumentada após o isolamento CD11c magnética onde o total de pulmão CDC foi incrementado cerca de 10 times (> 16%) desde a preparação original (Fig. 2A). No entanto, as células CD11c expressar baixas quantidades de MHC-II (CD11c oi / MHC-II eis que macrófagos) representou uma população de células de alta contaminação (> 70%), que foi misturado com o subconjunto CDC pulmão. Como mostrado na figura. 2B, essas células foram eliminados após a etapa de separação de células, quando a pureza do CDC chegou a> 96%. O rendimento habitual do CDC, após todo o procedimento foi de 5 x 10 4 células / pulmão. Microfotografias mostram características morfológicas do CDC como células arredondadas com as dendrites típicas (painel superior). Por outro lado, CD11c oi / MHC-II representaram um subconjunto lo morfologicamente diferentes que mostra protuberâncias celulares que são típicas de macrófagos (MΦ painel, menor) 12.

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Figura 1. Diferencial de freqüência DC no pulmão do rato e do baço. Um pulmãond tecido do baço de camundongos C57BL / 6 foram coletados e tratados com colagenase. Após digestão com colagenase, as células foram marcadas com anti-mouse CD11c-PE-Cy7 e anti-mouse IA / IE-FITC. Parcelas representativas de citometria de fluxo mostram percentuais de CDC (CD11c oi / MHC-II oi) no pulmão e baço.

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Figura 2. Isolamento de CDC do pulmão do rato. Rato pulmão suspensão única célula foi marcado com anti-CD11c micro e passou por um separador automático de células. A) Um representante trama mostra os percentuais de CDC (CD11c oi / MHC-II oi) e macrófagos (MΦ, CD11c oi / MHC-II lo) após o enriquecimento CD11c populações. Coloração mais da fração enriquecida seguido usando anti-mouse CD11c-PE-Cy7 e anti-mouse IA / IE-FITC. Duplo células positivas foram classificadas e analisadas por citometria de fluxo. Paraidentificar sua morfologia, as células foram cytospun e marcadas com uma coloração modificada Wright-Giemsa. B) parcelas Representante mostram percentuais de CDC e MΦ após separação de células. Microfotografias mostram uma imagem representativa do pulmão CDC e MΦ pulmão. Barra de escala = 20 mM.

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Discussão

Isolamento de pulmonar do rato DC é uma técnica importante para o estudo de uma ampla gama de estímulos respiratórios. O processo de obtenção dessas células inclui passos críticos que impedem a perda de células, bem como a viabilidade celular e pureza. Perfusão do pulmão antes da coleta ajudará a eliminar as células periféricas, bem como reduzir os eritrócitos contaminantes. O uso da dissociação automatizado pode ser advanteogus quando um grande número de pulmões são tratados, caso contrário, você pode optar pelo protoc...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Marilyn Dietrich no Centro de Núcleo LSU Citometria de Fluxo por sua ajuda com a separação de células e Mottram Peter por sua ajuda com as microfotografias. Este trabalho foi financiado pela Flight Attendant Medical Research Institute, da LSU-Competitiva Prêmio Programa de Pesquisa, e os subsídios NIH / NIAID P20 RR020159 e R03AI081171.

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Materiais

Nome do reagente Companhia Número de catálogo Comments (opcional)
Tampão de lise ACK Invitrogen D6-0005DG
Anti-camundongo CD11c (HL3) BD PharMingen 5580979 PE-Cy7 conjugados
Anti-camundongo IA / IE (269) BD-PharMingen 553623 FITC conjugado
Collangenase tipo 1A Sigma 9891-500mg
Filtros celular BD Falcon 352340, 352360
CD11c (N418) microesferas Miltenyi 130-052-001
DNase I Sigma D5025-150KU
Solução salina balanceada de Hank Invitrogen 14170
Solução tampão Hepes Invitrogen 15630
Placas de Petri 60 milímetros BD Falcon 351016
GentleMACS ™ C tubos Miltenyi 130-093-237
Dissociator MACS gentil Miltentyi 130-093-235
AutoMACS-Pro ™ Miltenyi 130-092-545
FASCS Aria BD

Referências

  1. Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
  2. Banchereau, J. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
  3. Manicassamy, S., Pulendran, B. Dendritic cell control of tolerogenic responses. Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).
  4. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).
  5. Asselin-Paturel, C. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).
  6. Chan, C. W. Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity. Nat. Med. 12, 207-213 (2006).
  7. Taieb, J. A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance. Nat. Med. 12, 214-219 (2006).
  8. Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections. Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).
  9. Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).
  10. Sung, S. S. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).
  11. Wang, H. Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process. J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).
  12. Bhatia, S. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).
  13. Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).
  14. Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection. J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).

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