Mapeamento de Difusão Molecular na membrana plasmática por Multiple-Target Tracing (MTT)

Summary

Multiple-alvo é um algoritmo de rastreio caseiro desenvolvido para controlar individualmente moléculas marcadas no interior da membrana plasmática de células vivas. Detecção eficaz de, estimar e rastreamento de moléculas ao longo do tempo a alta densidade de fornecer uma ferramenta de fácil utilização, abrangente para investigar a dinâmica da membrana em nanoescala.

Abstract

Nosso objetivo é obter uma descrição detalhada dos processos moleculares que ocorrem em membranas celulares em diferentes funções biológicas. Temos o objetivo de caracterizar a organização complexa e dinâmica da membrana plasmática a nível molécula única, através do desenvolvimento de ferramentas analíticas dedicadas a uma única partícula Tracking (SPT) em alta densidade: Multiple-Target de rastreamento (MTT) ^1. Uma única molécula de videomicroscopia, oferecendo milissegundo e nanométrica resolução ^1-11, permite uma representação detalhada da organização da membrana ^12-14 com precisão o mapeamento descritores, tais como receptores de células de localização, mobilidade confinamento, ou interações.

Nós revisitado SPT, tanto experimentalmente e através de algoritmos. Aspectos experimentais incluíram optimizar a instalação ea marcação celular, com um ênfase particular ao atingir a densidade de rotulagem mais alta possível, a fim de proporcionar um instantâneo dinâmico de um dinâmica moleculars que ocorre no interior da membrana. Questões algorítmicas preocupado cada passo usado para a reconstrução trajetórias: a detecção de picos, a estimativa e religação, dirigida por ferramentas específicas de análise de imagem ^15,16. Implementar deflação após a detecção permite picos de resgate inicialmente oculta por vizinhos, os picos mais fortes. De nota, melhorando a detecção impacta diretamente a reconexão, reduzindo as lacunas dentro de trajetórias. Performances foram avaliados através de simulações de Monte Carlo para a densidade de rotulagem e vários valores de ruído, que normalmente representam as duas grandes limitações para medições paralelas na resolução espaço-temporal alta.

A precisão nanométrica ¹⁷ obtido para moléculas individuais, utilizando quer sucessiva de ligar / desligar óptica photoswitching ou não-linear, pode fornecer observações exaustivos. Esta é a base de métodos Nanoscopia ¹⁷ como STORM ^18, PALM ^{19,20, 21} ou RESOLFT STED ^22,23, whiCH podem muitas vezes exigem amostras de imagens fixas. A tarefa central é a detecção e estimativa de difração limitada picos que emanam de um único moléculas. Assim, fornecendo pressupostos adequados, tais como lidar com uma precisão posicional constante em vez do movimento browniano, MTT é diretamente adequado para análises nanoscópicas. Além disso, o MTT pode fundamentalmente ser utilizado em qualquer escala: não só para as moléculas, mas também para células ou animais, por exemplo. Assim, o MTT é um algoritmo de seguimento poderoso que encontra aplicações em escalas moleculares e celulares.

Protocol

Neste vídeo, apresentamos um experimento de acompanhamento integral única partícula, usando-pontos quânticos direcionados para um receptor de membrana específico. O principal objectivo desta experiência consiste em discriminar diferentes tipos de comportamentos difusão molecular medidos no interior da membrana plasmática de células vivas. Com efeito, os movimentos moleculares resultantes na membrana pode desviar-se tipicamente de difusão Browniano sendo linearmente dirigida ou confinada dentro nanodomains ^26-29, por exemplo. Temos o objetivo de, simultaneamente, seguindo como muitos receptores como tecnicamente possível, para fornecer um instantâneo da variedade resultante na dinâmica que ocorrem no interior da membrana de uma célula viva. Isto é, em última análise esperado para permitir decifrar dos mecanismos que regulam a sinalização celular dos receptores de superfície.

1. Cultura de Células

1. Preparar a amostra celular: usar aderentes células COS-7 que expressam endogenamente o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) ^30. Quandotrabalhar com células vivas sem antibióticos certifique-se de não ter nenhuma contaminação sub-detectável latente mediante a utilização de técnicas estéreis em todos os momentos durante a preparação.
2. Crescer as células em meio completo (DMEM com 10% de soro de vitela, 1% de glutamina, HEPES 1% e piruvato de sódio 1%, ver tabela de reagentes específicos a seguir), a 37 ° C, com 7% de CO _2, tendo o cuidado de tê-los em sub-confluentes crescimento exponencial, antes de espalhá-las em Lab-Tek.
3. No dia antes da experiência, a propagação de 5.000 células / poço em 8-bem câmaras (Lab-Tek) e incubar durante a noite. Contagem de células assegura uma densidade constante de célula, portanto, um rácio reprodutível de Quantum-pontos por célula.

2. Marcação celular

Preparar quantum-pontos com um revestimento específico. Quantum-dots são nanopartículas fluorescentes, composto de semicondutores. Estas nanopartículas são de grande interesse, porque eles são muito brilhantes e fotoestável comparado ao clássicosondas fluorescentes ^31,32, o que permite realização de um sinal apropriado para-ruído (SNR) para geração de imagens única molécula.

1. Antes do experimento, produzir fragmentos Fab contra EGFR a partir de linha de células de hibridoma (mAb 108, ATCC HB-9764), por digestão com papaína, como descrito anteriormente ^21.
2. Conjugado Fab com biotina, como por instruções do fabricante (EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotinilação Kit; Thermo Scientific, Fig. 1A.).
3. Use quantum-dots funcionalizados com estreptavidina (Invitrogen) e emissor de a 605 nm (comprimento de onda de emissão óptimo para a detecção de brilho, e separação de autofluorescência celular).
4. Preparar a solução de rotulagem em meio completo (ver tabela de reagentes específicos), a fim de saturar as streptavidins presentes em torno dos pontos de Quantum-, bem como para prevenir a agregação e ligação não específica para as células e para a lamela.
5. Prepare duas soluções intermediárias:um com quantum-dots-estreptavidina e outro com Fab biotinilado, cada uma a 20 nM.
6. Misturar um volume igual de estas duas soluções: misturar os pontos quantum-com Fab na relação de 1:1 para se obter uma concentração final de trabalho de 10 nM Fab: Quantum-pontos complexos. Usando uma proporção equimolar favorece a formação de mono-funcionalizados complexos compostos de um quantum-ponto e um fragmento Fab biotinilado. Isto favorece a rotulagem monovalente, limitando observações artefacto, devido à ligação cruzada do receptor ^33,34.
7. Incubar durante 15 minutos a 25 ° C, utilizando um agitador a 1.200 rotações por minuto para evitar a agregação. A mistura é então pronto para usar em células vivas.
8. Incubar as células em 100 uL de mistura durante 5 minutos a 37 ° C, com _7% de CO2.
9. Lave as células com os não-autofluorescente meio de imagem (HBSS tampão, HEPES 1%, ver tabela de reagentes específicos) pré-aquecida a 37 ° C.
10. Cuidadosamente remover o excesso de rótulos para evitar unnecessário estragar o SNR por não acoplado, fora do foco quantum-pontos, por lavagem extensivamente cada poço com imagem latente médio, normalmente de 5 vezes à temperatura ambiente, com pelo menos 5 minutos atraso antes da última lavagem.

3. Configuração óptica

A configuração de vídeo-microscopia é composto de quatro partes principais:

1. Um microscópio invertido com um cubo específico de fluorescência (excitação FF01-457/50, FF495-DI02 dicróico, e FF01-617/73 filtros de emissão, Semrock) e uma alta abertura numérica (1,3 ou 1,49) óleo de imersão-100x objectivo.
2. Uma lâmpada de mercúrio de 100 W (acoplado ao microscópio através de uma fibra óptica, evitando a interferir com a termorregulação).
3. Um 512 x 512 pixels sensibilidade elevada EMCCD câmara para atingir um SNR suficiente.
4. De uma incubadora para manter as amostras biológicas, a 37 ° C durante a experiência.

4. Aquisição

1. Selecione as células isoladas e bem-propagação. Estefavorece a extensão da lamellipodia, belo apartamento, melhor adaptada a olhar para o movimento planar das moléculas da membrana.
2. Avaliar o estado fisiológico celular por sua aparência, tanto na luz transmitida e da fluorescência: tráfego vesicular intenso, ausência de sinais de necrose ou apoptose e autofluorescência baixa e média-forte de rotulagem quantum-dot (normalmente até 1.000 Quantum-pontos por célula, consulte Fig. 1B, C).
3. Selecione uma densidade de rotulagem elevado, o que é fundamental para monitorar simultaneamente receptores tantas quanto possível. Esta é realmente limitado, tanto pela fisiológico (expressão de superfície, a acessibilidade epítopo, o movimento lateral) e os parâmetros de algoritmos (não sobrepostos ponto propagação da funções (PSF), mesmo tendo em conta a desfocagem devido ao movimento, para permitir a detecção adequada e reconexão).
4. Para cada célula, em primeiro lugar adquirir uma imagem de campo de campo claro (de preferência utilizando DIC, se disponível), que pode ainda permitir a verificação para o aspecto de célulase os limites espaciais do lamellipodia.
5. Salve esta imagem com o mesmo nome do vídeo-stack (como cell1.tif & cell1.stk por exemplo), em uma sub-pasta chamada dic, uma vez que, com essas convenções, o algoritmo pode encontrar automaticamente para trás a imagem correspondente para cada pilha.
6. Adquirir 1 a 3 vídeos por celular, de forma contínua, normalmente em 36-ms taxa, a taxa mais rápida possível em full frame com esta câmara. No entanto pode-se adquirir em freqüências mais altas, até 1-ms taxa, usando CCD dedicado com maior sensibilidade e / ou menos pixels. A tecnologia de transferência de quadro fornece atraso insignificante entre os quadros.
7. Electron melhoria multiplicam deve ser sempre ajustado no máximo (abaixo de saturação, se for o caso) para permitir atingir a sensibilidade única molécula, com um SNR suficiente, pelo menos acima de 20 dB (para detecção de pico eficiente ^1), normalmente em torno de 25-30 dB.
8. Normalmente, adquirir 300 quadros por pecado de vídeo,ce trajetórias são reconstruídos sobre ~ 100 quadros, em média, em sua maioria limitados por longas eventos que piscam. Frequência de vídeo e de comprimento pode ser adaptado para uma determinada medida, o que poderia exigir vestígios mais longos, por exemplo.

5. Análise de MTT

1. Selecione o caminho para o diretório contendo os arquivos de vídeo para avaliar um conjunto de dados fornecido com Matlab ou Octave.
2. Para iniciar a análise totalmente automatizado ^1,35, digite o comando detect_reconnex23 em Octave, ou MTT23i em Matlab. Este programa representa a "versão 2.3, com interface de usuário" e está disponível para download, juntamente com a versão anterior 2.2. É primeiro exibe uma interface gráfica listar todos os parâmetros utilizados, como mostrado na fig. 2.

6. Os resultados representativos

MTT analisa automaticamente cada gravador de vídeo, para entregar os traços de alvos detectados e estimados, complementadas por outros emInvestigações, tais como detecção de confinamento. Esta última análise, permite que vestígios de mapeamento sobre as imagens de células (Fig. 1C e 3).

Descrição MTT

A análise de MTT núcleo é executada através de cada quadro, invocando 3 tarefas principal (Fig. 3):

1. Detecção da presença ou ausência de um alvo (quantum-ponto), dentro de uma sub-região de deslizamento sucessivamente centrada em torno de cada pixel, onde duas hipóteses são comparados: presença quer de um sinal, com o PSF modelized como um bi-dimensional Gaussian pico , ou apenas o ruído, utilizando um limiar de alarme segurar o suficiente baixa falso, com menos de uma detecção espúrio por quadro. Isto leva a um mapa de probabilidade de detecção. Cada máximo local é considerado como um alvo putativo, assegurando que o seu nível de probabilidade é maior do que um valor mínimo, definido de acordo com a probabilidade desejada de falso alarme (PFA). Esse limite é definido baixa o suficiente para discriminar com eficiência signais de ruído, evitando, na melhor das detecções falsas (PFA de 10 ^-6 por padrão, para garantir a menos de um erro em 512 x 512 pixel imagens), permitindo ainda uma probabilidade suficientemente elevada de detecção, atingindo o ¹ previsto teoricamente ideal. Note-se que a necessidade de usar uma sub-região implica que as fronteiras de imagem (3 pixels, para uma janela padrão de 7 x 7 pixels) não pode ser avaliada.
2. Estimativa, para cada alvo detectado, dos parâmetros relevantes, tais como sub-pixel de posição e intensidade do sinal. Para cada alvo detectado, pelo menos um-quadrado ajuste de Gauss-Newton é em seguida realizada para estimar a posição, largura e altura do Gaussian detectado. Isto proporciona nomeadamente a posição de subpixel do corante (10 a 20 nm para exatidão valores típicos da SNR e corantes imóvel ou lentamente difusão, aumentando até ~ 100 nm para corantes difusão a 0,1 uM ² / s).
3. Reconexão das novas metas com otraços já construiu ao longo dos quadros anteriores. O conjunto de novas metas é combinado com o conjunto de traços anteriores. Para este efeito, a fim de atribuir a cada alvo a um traço, se possível, todas as informações disponíveis estatístico obtido a partir do passo de detecção é usado, não só a posição, mas também a intensidade, a largura de piscar e estatísticas associadas. Assim, as metas não são designadas para o próximo traço: em caso de vestígios de passagem, intensidade, velocidade, largura e piscando será considerada. Isto proporciona a pontuação reconexão estatisticamente ideal. Essa estratégia evita, quando possível, a polarização do reconexão em direção aos vizinhos mais próximos.

Picos detectados pode ser rejeitado se a posteriori a sua estimativa ou reconexão falha. Um teste especial trata a detecção de novos picos, o que poderia iniciar vestígios novos. Este teste utiliza um PFA mais rigoroso (10 ^-7), uma vez que voltar a ligar um pico a um traço pode ser interpretada de facto como um ó validação f sua relevância (este critério ser, por definição, não é aplicável para novos picos).

Análise da trajetória

Confinamento transiente possível é em seguida avaliada por uma função inversamente relacionada com a difusão local ^24-29. Aplicando um limiar permite definir confinado ou não episódios. Iterando sobre todos os vestígios destes, podemos mapear a dinâmica da membrana, em termos de confinamento transitória / desacelerar eventos. Isto pode ser alternativamente representado usando o binário ou valores discretos da presente índice confinamento.

Por padrão, o MTT executa automaticamente as tarefas, economizando 8 parâmetros de pico em um arquivo de texto: número de quadro, i e j posição, intensidade de sinal, raio, offset e piscar, para cada quadro do vídeo (grupo de 7 linhas) e trace (coluna) . Estes parâmetros de saída pode ser recarregado em Matlab ou Octave usando o script fread_data_spt para continuar a analisar os vestígios ou seja, ou de intensidade de sinal, como exemplificado na "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> MTT_example roteiro em anexo.

Outras análises levar a mapear vestígios sobre cada célula (Fig. 1C e 3) e para proporcionar uma distribuição do histograma para os parâmetros relevantes (tais como as intensidades de pico, ou valores SNR de difusão locais). Para cada arquivo, média e desvio padrão de cada parâmetro são salvos em um arquivo de texto, juntamente com uma imagem dos histogramas. Distribuições logarítmicas, tais como, por deslocamentos quadrados r ^2, levar a média geométrica. O coeficiente de difusão D é calculado a partir de um ajuste linear ao longo dos cinco primeiros pontos da curva de MSD. Esses valores fornecem uma visão geral de um experimento envolvendo a cinética exemplo de reações celulares ou tratamentos farmacêuticos / enzimática que afetam a organização da membrana. Uma vez que MTT é um código de fonte aberta, este aspecto pode ser prontamente adaptado para qualquer investigação dedicado.

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Figura 1. Monitorização dinâmica receptores de membrana por MTT. Componentes (a) a membrana, tais como o EGFR, são marcados com quânticos-pontos acoplados a fragmentos Fab biotinilado (desenho esquemático com raspagem aproximadamente correcta de cada molécula). (B) da imagem fluorescente típica adquirido a partir de um vivo COS-7 de células, com 36-ms de tempo de exposição, que descreve difracção limitada picos correspondentes ao receptor individualmente rotulado. (C) de saída da análise de MTT exibindo as trajectórias reconstituídos dos receptores, cobrindo a imagem de campo claro da célula.

Figura 2. Parâmetros de entrada MTT. Correndo MTT23i abre uma interface gráfica de usuário listando todos os parâmetros de entrada, nomes e valores padrão, como descrito em nossa publicação anterior ^1. Nos parâmetros espaciais algoritmo, eo tempo (janelas de pesquisa, o raio de pico, a difusão máxima e piscando) são adimensionais em unidades padrão, pixels e quadros. Calibrações pode ser aplicado a posteriori para converter resultados de saída. Os valores padrão, correspondente a um 512BFT Cascade com ampliação de 100x, são o tamanho do pixel: 156 nm / pxl e atraso quadro: 36 ms / frame.

Os investigadores devem otimizar alguns parâmetros críticos, tais como o coeficiente de difusão máxima esperada ("Diff max") e desaparecimento de piscar máximo ("T _off"). Estes dois limites de espaço e tempo são quase os únicos que precisam de ser reexaminadas para uma determinada condição experimental, sendo os outros definidas para valores padrão robustos. Por exemplo, o número de falsos alarmes está directamente definido para garantir menos de um erro por milhão de pixels, por conseguinte, menos do que um por quadro, o que é satisfatório na maioria dos casos. Todos os parâmetros são salvos em um arquivo de texto na pasta de saída, permitindo que os usuários verifiquem posteriormente as configurações que foram usadas para análise.

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Figura 3. Principais passos de a análise de MTT. Partindo de uma pilha experimental de imagens de fluorescência, os picos são sequencialmente e automaticamente detectado, estimada por um ajuste de Gauss e religado ao longo quadros (primeira gama de operações, parte superior do fluxograma). Traços pode ainda ser analisado para o confinamento putativo, por exemplo, em última análise, levando a um mapa dinâmico de descritores relevantes (segunda gama de operações, parte inferior).

Figura 4. Valência rotulagem não tem impacto sobre MTT. Para avaliar o possível viés introduzido pela rotulagem multivalente artefactual, análise de MTT foi realizado para rastrear EGFR endógeno marcado com 2 esquemas diferentes, para gerar e analisar mapas de trajetórias. (A) receptores foram marcados com Fab biotinilado e quantum-dots605-estreptavidina, como descrito no protocolo.Neste caso, a valência de multi-quantum-pontos e streptavidins pode resultar em vários receptores de acoplamento a um corante único. (B) receptores foram marcados com Fab directamente acoplado a um corante orgânico, Atto647N. Neste caso, um Fab, portanto, um receptor, pode ser acoplado a mais do que um corante. (C) A média de deslocamento da curva quadrada (MSD) foi calculada para todos os traços de cada célula, rotulado ou com quantum-dot ou corantes ATTO (gráficos esquerda e direita, respectivamente). Coeficientes de difusão foram computados por ajuste linear ao longo dos cinco primeiros pontos da MSD (linha vermelha pontilhada). Cada esquema de marcação levou a valores de difusão semelhantes (gráfico central). Qdot: quantum-dots605 (n = 5 células), Atto: Atto647N (n = 7 células), ns: não significativo (teste t de Student valor p> 0,05).

Discussion

Em uma única partícula de rastreamento, ao lado dos aspectos de células e microscopia, a análise representa uma parte substancial do trabalho. Isso resolve o algoritmo usado para executar as três tarefas principais: detectar, estimando-se e reconectando picos em cada frame. Mas o aspecto conseqüente deste trabalho reside na elaboração do algoritmo em si, que podem precisar ser adaptado para qualquer nova investigação dedicada, essencialmente, para os últimos, os passos extras (como decifrar os modos de movimentos, inter...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente	Companhia	Número de catálogo	Quantidade
Linha COS-7 de células	ATCC	CRL-1651	5.000 células / poço
HBSS sem Ca2 +	GIBCO	14175	1 ml
0,05% de tripsina EDTA	GIBCO	25300	1 ml
8-bem Lab-Tek	NUNC	155441	1
QDot-605 estreptavidina	Invitrogen	Q10101MP	20 mM
Fab biotinilado (para a síntese de Fab, ver referência 21)
Fab de mAb 108	ATCC	HB-9764	200 g
NHS-biotina	Thermo Scientific	21435	18,5 mg
Conclua médio
DMEM	GIBCO	41965	500 ml
Soro Fetal Bovino	SIGMA	F7524	50 ml
L-Glutamina	GIBCO	25030	5 ml
HEPES	GIBCO	15630	5 ml
Piruvato de sódio	GIBCO	11360	5 ml
Imagem médio
HBSS com Ca2 +	GIBCO	14025	25 ml
HEPES	GIBCO	15630	250 ul