Células musculares cultivadas são um modelo inadequado para recapitular músculo inervado In vivo. Uma unidade de motor funcional pode ser reproduzida In vitro Por inervação diferenciados humanos células musculares de ratos embrionários primários usando explantes da medula espinhal. Este artigo descreve como co-culturas de explantes da espinal medula e células musculares são estabelecidos.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
A Unidade Funcional Motor na placa de cultura: Co-cultivo de explantes da Medula Espinhal e as células musculares
Neste artigo
Resumo
Resumo
Humanos células musculares primárias cultivadas em monocamada aneurally raramente contrato espontaneamente, porque, na ausência de um componente do nervo, diferenciação celular é limitada e motor estimulação neuronal está ausente 1. Estas limitações dificultar o estudo in vitro de muitas doenças neuromusculares em células musculares em cultura. Importante, as restrições experimentais de monolayered, células musculares em cultura pode ser superado pela inervação funcional de miofibras com explantes da medula espinal em co-cultura.
Aqui, nós mostram os diferentes passos necessários para atingir um inervação, eficiente adequado de células musculares humanos primários, levando à completa contracção diferenciação e de fibras de acordo com o método desenvolvido por Askanas 2. Para fazer isso, as células musculares são co-cultivadas com explantes espinal medula de embriões de ratos em ED 13,5, com o gânglio da raiz dorsal ainda ligado às fatias de medula espinhal. Depois de alguns dias, o músculo fibros começar a contrato e, eventualmente, tornar-se cruz-estriado através inervação por neurites funcionais projetando a partir dos explantes da medula espinhal que ligam para as células musculares. Esta estrutura pode ser mantida durante vários meses, simplesmente por troca regular do meio de cultura.
As aplicações desta ferramenta de valor inestimável são numerosas, pois representa um modelo funcional para análises multidisciplinares de desenvolvimento muscular humana e inervação. Na verdade, uma completa de novo instalação junção neuromuscular ocorre em um prato de cultura, permitindo uma fácil medição de muitos parâmetros em cada passo, num contexto fundamental e fisiológico.
Só para citar alguns exemplos, genômicos e / ou estudos de proteômica pode ser realizada diretamente sobre as co-culturas. Além disso, os efeitos pré e pós-sináptica pode ser e especificamente avaliados separadamente na junção neuromuscular, porque ambos os componentes vêm de diferentes espécies,de rato e humano, respectivamente. O nervo músculo-co-cultura pode também ser realizada com células musculares humanas isoladas de pacientes que sofrem de músculo ou doenças neuromusculares 3, e assim pode ser usado como uma ferramenta de rastreio de drogas candidatas. Finalmente, nenhum equipamento especial, mas uma instalação de BSL2 regular é necessária para reproduzir uma unidade de motor funcional em um prato de cultura. Este método, assim, é valiosa para ambos o músculo, bem como as comunidades de investigação neuromusculares para estudos fisiológicos e mecanicista da função neuromuscular, num contexto normal e doença.
Protocolo
1. Preparação da cultura de células humanas muscular primária
- Estabelecer as culturas de células humanas musculares de acordo com a técnica de explante-re explante-4. Primeiro, remova não-tecido muscular das biópsias. Em seguida, incorporar 1 mm 3 explantes musculares em um coágulo de plasma, que permite que os fibroblastos de emergir dos explantes.
- Os explantes incorporados são transferidos para um prato de plasma gelatina revestido e deixá-los crescer em meio de crescimento normal (MEM suplementado com meio de 25% 199, 10% de soro fetal bovino [FBS], 1% de penicilina / estreptomicina, 10 insulina ug / ml, 10 ng / ml factor de crescimento epidérmico humano [EGF], 12,5 ng / ml factor de crescimento fibroblástico humano [FGF]) em uma monocamada. As células que surgem a partir dos explantes sob essas condições são as células musculares. Estas células continuam a crescer em uma monocamada após a remoção dos explantes.
- Cultura das células aneurally 0,1% de gelatina em placas revestidas em meio de crescimento normal. As células podem seraneurally cultivadas e amplificadas, conforme necessário. É preferível utilizar células musculares em uma passagem entre 3 e 8 para executar os co-culturas. É fundamental para inervar miotubos jovens, após este ponto, as co-culturas têm um alto risco de fracassar. Além disso, miotubos não deve ser demasiado grande e muito espessa.
- Dois dias antes da inervação está prevista placa, as células musculares em 35 pratos de tecido mm de cultura (ou 6 placas de poços) com uma densidade de 500.000 células por placa em meio de crescimento normal. Em que a densidade, as células estão na confluência adequada para iniciar a fusão no dia seguinte, e subsequente inervação do dia depois disso. Utilizando essas condições, os miotubos estão na fase certa para inervação ideal e contração das fibras, portanto, posterior.
- No dia seguinte, substituir o meio de crescimento normal, com uma média de fusão composta de MEM suplementado com meio de 25% 199, 5% de FBS, a insulina 10 mg / ml e 1% de penicilina / estreptomicina.
2. Isolati no do rato embrionárias Explantes da Medula Espinal
Todo o procedimento para isolar os explantes da medula espinal é realizada sob um microscópio binocular, em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS, Gibco / Invitrogen ref 14.170) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS).
- É crucial que os embriões de ratos estão entre ED 13 e 14 como um estágio de desenvolvimento diferente comprometeria todo o processo. Sacrifique uma mulher grávida com CO 2 e recolher a cadeia embrião inteiro em meio HBSS. Isolar cada embrião e decapitar as crianças para a eutanásia.
- Dissecar a medula espinal embrionária do resto do corpo de uma só peça e remover o músculo e tecido conjuntivo envolvente. Tenha muito cuidado para manter os gânglios da raiz dorsal (DRGs) ligados à medula espinhal para garantir a inervação funcional.
- Cada fatia da medula espinal transversalmente de uma maneira que cada explante contém pelo menos 2 DRG ligada a ela (explantes de 1 mm 3).
- Remover o meio de fusão sobre a cultura de células do músculo, deixando uma fina camada de meio sobre a monocamada.
- Coloque os frascos cuidadosamente sobre a camada de células musculares, cinco explantes uniformemente espaçadas por 35 prato mm.
- Adicionar muito lentamente, solte meio de fusão sábio, em cada explante. É necessário adicionar meio para as células musculares para sobreviver, mas não demasiado para permitir que os explantes a aderir primeiro e fazer contacto com as células. Se o meio não é adicionado corretamente (muito forte ou médio muito), os explantes irá flutuar e irá falhar para inervar as células musculares.
- Uma vez que os explantes começar a aderir, no topo da média de fusão a 2 ml por 35 prato mm, e pôr os pratos com muito cuidado de volta para a incubadora.
4. Manutenção dos heterólogos nervo-músculo Co-culturas
- Alterar o meio de fusão duas vezes por semana.
Logo que dois dias depois da inervação, é possível ver as neurites que emergem de cada explante e estabelecimento de contactos com as células musculares, representados pelas estruturas botão-like (Fig. 1).
Já em 4-6 dias após a inervação, algumas fibras individuais começará a se contrair.
As contracções persistir durante vários meses, mantida simplesmente mudando o meio de cultura duas vezes por semana.
Após cerca de 2 semanas, o explante medula espinal-se degenera, mas a inervação é conservada. Isto é normal. Uma fina camada de componente do nervo permanece na superfície da camada de células do músculo. Esta rede nervoso é suficiente para manter a funcionalidade do bloco do motor.
Se os explantes flutuar no meio de um dia após a inervação, eles nunca irá aderir. Isto acontece quando a camada de células do músculo énão é suficientemente confluentes, ou quando o meio é adicionado demasiado aproximadamente. Às vezes, os explantes, mas não adere neuritos surgirão. Isto é provavelmente devido à falta de DRG ligado a ele. Neste caso também, a inervação não será estabelecida. Manipular os pratos com muito cuidado na primeira semana, como os explantes ainda pode se desprendem facilmente. Para trocar a mídia de fusão, adicionar o líquido gota a gota com uma velocidade mínima para evitar desprendimento de células.
Figura 1. Da medula espinhal célula muscular explantes co-culturas do dia 1 ao dia 15.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Uma ferramenta fisiológica in vitro para estudar a função da célula muscular em contexto normal e patológico é do maior interesse para os myologists, porque as culturas de células musculares geralmente não recapitular a importância de várias células e células do tipo conexões. A adição de neurónios motores purificado para as células musculares não é suficiente para alcançar uma unidade de motor funcional uma vez que a presença de células de Schwann é necessária para a inervação para ser eficiente 5, ...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Nosso trabalho é apoiado pela National Science Foundation suíço (SNF), a Iniciativa Suíça em Biologia de Sistemas (SystemsX.ch), a Muscular Dystrophy Association EUA (MDA), a Associação Française contre les Miopatias (AFM), o United mitocondrial Doença Fundação (UMDF), a Gebert-Ruf Fundação Programa das Doenças Raras (GRF), a Sociedade Suíça de Investigação das doenças musculares (SSEM / FSRMM), a Swiss Life "Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit und Forschung medizinische", a Roche Research Foundation e da Universidade de Basileia.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de Catálogo | |
| HBSS | Gibco / Invitrogen | 14170 | |
| MEM | Gibco / Invitrogen | 31095 | |
| Meio 199 | Gibco / Invitrogen | 31153 | |
| Soro Fetal Bovino | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insulina | Sigma | I9278 | |
| EGF humano | Sigma | E9644 | |
| FGF humano | Sigma | F0291 | |
| A penicilina / estreptomicina solução | Gibco | 15140 |
Referências
- Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions. Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).
- Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation. J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).
- Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy. Lancet. 345, 694-695 (1995).
- Askanas, V., Engel, W. K. A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture. Neurology. 25, 58-67 (1975).
- Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro. Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).
- Lefebvre, S. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell. 80, 155-165 (1995).
- Schrank, B. Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).
- Hsieh-Li, H. M. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).
- Monani, U. R. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).
- Durbeej, M., Campbell, K. P. Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. 12, 349-361 (2002).
- Schnabel, J. Neuroscience: Standard model. Nature. 454, 682-685 (2008).
- Benatar, M. Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS. Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).
- Dorchies, O. M. Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system. Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).
- McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies. Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
