Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Eletroporação RNAi no Cortex Cerebral Murina embrionárias

Resumo

Para realizar uma avaliação rápida da função de genes no desenvolvimento de córtex cerebral, que descrevem métodos que envolvem a Ex vivo Electroporação de plasmídeos co-expressando RNA inibitória (RNAi) e GFP no córtex embrionário de murídeo. Este protocolo é favorável ao estudo de vários aspectos do neurodesenvolvimento, como neurogênese, migração neuronal e morfogênese neuronal incluindo dendrito e crescimento axonal.

Resumo

O córtex cerebral dirige funções cognitivas superiores. Esta estrutura de seis camadas é gerado no interior um do primeiro, a maneira de fora para último, em que os neurónios primeiros nascidos permanecem mais próximos do ventrículo enquanto que os neurónios últimos nascidos migrar passado os neurónios primeiros nascidos no sentido da superfície do cérebro ^1. Além disso a migração neuronal ^2, um processo chave para a função cortical normal é a regulação da morfogénese neuronal ^3. Enquanto morfogênese neuronal pode ser estudada in vitro em culturas primárias, há muito a ser aprendido a partir de como esses processos são regulados em ambientes de tecido.

Nós descrevemos técnicas para analisar a migração neuronal e / ou morfogénese em fatias organotípicas do córtex cerebral ^4,6. Um vetor pSilencer modificado é usado que contém um promotor U6 que impulsiona as duplas de RNA hairpin encalhados e um cassete de expressão separado que codifica a proteína GFP dirigido bya promotor de CMV ^7-9. Nossa abordagem permite a rápida avaliação de defeitos no crescimento de neuritos em knockdown específica de genes candidatos e tem sido utilizado com sucesso em uma tela para os reguladores de crescimento neurite ^8. Como apenas um subconjunto de células irão expressar as construções RNAi, as fatias organotípicas permitir uma análise do mosaico dos fenótipos potenciais. Além disso, porque esta análise é feita de uma aproximação próxima da ambiente in vivo, ele fornece uma alternativa de baixo custo e rápida para a geração de animais transgénicos ou knockout para os genes de função desconhecida cortical. Finalmente, em comparação com a tecnologia in vivo electroporação, o sucesso de experiências de electroporação ex vivo não é dependente de desenvolvimento proficiente cirurgia habilidade e pode ser realizada com um menor tempo de formação e habilidade.

Protocolo

1. Preparar Soluções Cultura e Mídia (e não em vídeo)

1. Prepare 1 litro de solução de Hank completa do sal equilibrada (HBSS) contendo HBSS 1x, 2,5 mM de HEPES (pH 7,4), 30 mM de D-glucose, 1 _mM de CaCl2, 1 mM de _MgSO4 e 4 mM de _NaHCO3. Adicione a água bidestilada (DDH ₂ O). Filtrar esterilizar com um filtro de 0,2 mícrons e armazenar a 4 ° C.
2. Preparar meio de cultura usando fatia 35 mL de Basal Eagle Médium meios de comunicação, 12,9 mL de HBSS completos, 20 mM de D-glucose (1,35 mL de solução 1 M), 1 mM de Glutamax (0,25 mL de uma solução 200 mM), 0,5 ml de penicilina -estreptomicina estoque 100x. Filtr....

Discussão

Estes métodos envolvem a eletroporação ex vivo de plasmídeos codificando a fita dupla de RNA grampos ⁸ e cultura de fatias organotípicas ⁴ oferece diversas vantagens. Primeiro, estes métodos permitem uma avaliação rápida de RNAi derivados de fenótipos. A inclusão de uma GFP codificação expressão cassete no vector pSilencer mesmo que contém o promotor U6 que impulsiona o gancho de cabelo de ARN de cadeia dupla permite uma identificação rápida e caracterização de células electroporadas com o.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Hamilton seringa	HAMILTON	80008	31 gauge, 0,5 centímetros de comprimento, PT-4 (nível de chanfradura ponto), o volume de 10 ul
Tweezertrodes Platinum	BTX	45-0489	Tamanho 5 milímetros
ECM830 electroporator	BTX	45-0002
BTX Footswitch	BTX	45-0208	Para utilização com ECM830 electroporator
Vibratório micrótomo de lâmina	LEICA	VT1000 S
6 - prato bem para usar com inserções	FALCON	353502	Contém entalhes para encaixar inserções
Cultura inserções de tecido	FALCON	353090	0,4 micrômetro
Verde rápido	SIGMA	F7252
Baixo ponto de fusão Agarose	FISHER	BP165-25	DNA grau
A laminina	Sigma-Aldrich	L2020
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P5899
Basal Eagle Médium	Sigma Aldrich	B-1522
HBSS 10x sem Ca e Mg	GIBCO	14180-046
HEPES livre de ácido	Sigma-Aldrich	H4034