Uma abordagem para análise da migração e destino final dos aviários células da crista neural em codornas de-bico embriões quiméricos é descrito. Este método é uma técnica simples e direta para rastrear células da crista neural durante a migração e diferenciação que são de outra maneira difícil distinguir dentro de um embrião de galinha não-manipulado.
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Artigo de método
Análise de migração da crista neural e Diferenciação por Cross-espécies de Transplantes
Neste artigo
Resumo
Resumo
Embriões de aves fornecer uma plataforma única para o estudo de muitos vertebrados processos de desenvolvimento, devido ao fácil acesso dos embriões dentro do ovo. Quiméricos embriões aviários, em que as codornizes tecido do dador é transplantado para um embrião de pinto in ovo, combinam o poder de rotulagem genética indelével de populações de células com a facilidade de manipulação apresentada pela embrião aviário.
Quail chick-quimeras são uma ferramenta clássica para a detecção migratórias células da crista neural (CNCC) 1-3. CNCC são uma população transitória migratório das células do embrião, que se originam na região dorsal do tubo 4 desenvolvimento neural. Eles sofrem uma transição epitelial para mesenquimal e, posteriormente, migrar para outras regiões do embrião, onde se diferenciam em vários tipos celulares, incluindo cartilagem 5-13, melanócitos 11,14-20, neurônios e células gliais 21-32. CNCC são multipotentes, e seu destino final é influenciadoinfluenciada por 1) a região do tubo neural em que são originários ao longo do eixo rostro-caudal do embrião 11,33-37, 2) sinais de células vizinhas à medida que migram 38-44, e 3) o microambiente do seu final destino dentro do embrião 45,46. Rastreamento essas células a partir de seu ponto de origem no tubo neural, a sua posição final e destino dentro do embrião, fornece informação importante sobre os processos de desenvolvimento que regulam a padronização e organogênese.
Transplante de regiões complementares de tubo neural doador (homotópico do miocárdio) ou diferentes regiões do tubo neural do doador (enxerto heterotópico) pode revelar diferenças de especificação pré-CNCC ao longo do eixo rostro-caudal 2,47. Esta técnica pode ser ainda adaptado para transplantar um compartimento unilateral do tubo neural, tal que um lado é derivado a partir de tecido do dador, e os restos lado contralateral não perturbada no embrião hospedeiro, yielding um controle interno, dentro da mesma amostra 2,47. Ele também pode ser adaptado para o transplante de segmentos cerebrais em embriões mais tarde, após HH10, quando o tubo neural anterior foi fechada 47.
Relatamos aqui técnicas para a geração de codorniz chick-quimeras por transplantação tubo neural, que permitem a detecção de CNCC migratórios derivados a partir de um segmento discreta do tubo neural. Específica da espécie rotulagem das células derivadas de dador com o anticorpo QCPN codorniz-específica 48-56 permite que o pesquisador para distinguir dador e células hospedeiras no ponto final experimental. Esta técnica é simples, barato, e tem muitas aplicações, incluindo mapeamento de destino, a linhagem celular de rastreamento, identificação e padronização de pré-eventos ao longo do eixo rostro-caudal 45. Devido à facilidade de acesso para o embrião aviário, a técnica de enxerto codorniz-chick pode ser combinada com outras manipulações, incluindo mas não limitado a ablação da lente 40, a injecção de moléculas inibidoras 57,58, ou manipulação genética através de electroporação de plasmídeos de expressão 59-61, para identificar a resposta de determinados fluxos migratórias de CNCC a perturbações no programa de desenvolvimento do embrião. Além disso, esta técnica de enxerto pode também ser usado para gerar outros embriões interespecíficos quiméricos, tais como codorniz-pato quimeras para estudar NCC contribuição para a morfogénese craniofacial, ou rato chick-quimeras para combinar o poder de rato genética com a facilidade de manipulação do embrião aviário 62.
Protocolo
1. Incubar pintinho e ovos de codorna ao estágio desejado
Para HH9 embriões, os tempos de incubação típicos variam de 29-33 horas a 38 ° C. 63
- Lave todos os restos dos ovos com água morna.
- Organizar os ovos de galinha na bandeja horizontal. Marcar o lado virado para cima com lápis, o que irá corresponder à região onde o embrião será localizado. Incubar ovos de codorna fim brusco para cima.
- Lugar em 38 ° C incubadora umidificada. Ligue balançando função.
2. Prepare ovos para janelas e dissecção
- Remover os ovos de incubadora, e esterilizar os topos com e....
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Discussão
O enxerto de tubo neural em embriões de galinha codorna acolhimento descrito aqui é uma técnica simples e barata para rastreamento subpopulações específicas de migração CNCC provenientes de diferentes regiões ao longo do eixo rostro-caudal 21,67-69. Esta técnica tira vantagem da facilidade de acesso para embriões aviários (em comparação com os embriões de mamíferos) e pode ser combinada com outras técnicas, tais como a ablação do tecido, a injecção de moléculas inibidoras, ou através de manipulação genética d.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem os membros do laboratório Lwigale para a crítica do manuscrito. SLG é apoiado por uma L. Ruth Kirschstein NRSA Fellowship do National Eye Institute (F32 EY02167301). PYL é suportado pelo National Eye Institute (EY018050).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente | Companhia | Número de Catálogo | |
| Ovos Chick | Vários - usamos Texas A & M University Poultry Science Department, TX. | ||
| Ovos de codorna | Vários - usamos Ozarks Empresa Egg, MO. | ||
| Ovo incubadora (Digital Leitura 1502 Sportsman Incubadora w / Umidade 110-120 V CA) | www.poultrysupply.com | 1502 | |
| Dumont AA fórceps, Inox revestido de epóxi | Belas Ferramentas Ciência | 11210-10 | |
| Fita adesiva | Qualquer loja de material de escritório | ||
| Curvo Iris fórceps | Belas Ferramentas Ciência | 11065-07 | |
| Eundia tinta | Qualquer loja de material de arte | ||
| Pen / Strep Solution (penicilina, estreptomicina) | VWR International | 101447-068 | |
| A fita de embalagem clara | Qualquer loja de material de escritório | ||
| Agulha aparelho puxando | Narashige, Japão | PE-21 | |
| Agulha de vidro puxado, fez 1,5-1,8 tubo de vidro de borosilicato x 100mm capilar | Kimble perseguição | 34500 99 | |
| Puxado vidro pipeta, feita a partir de 5 ¾ "pipeta Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Aparelho de boca pipeta (tubo de aspirador de montagem para pipeta calibrada microcapilar) | Sigma-Aldrich | A5177-52A | |
| Dumont # 5 fórceps | Belas Ferramentas Ciência | 11251-30 | |
| Tonelarame gsten, diâmetro 0,1 milímetros | VWR International | AA10404-H2 | |
| Porta-agulhas (Niquelado titular pinos) | Belas Ferramentas Ciência | 26018-17 | |
| QCPN anti-soro | Desenvolvimento de Estudos Hybridoma Bank, da Universidade de Iowa | QCPN | |
| Alexa anticorpo Fluor secundário (por exemplo, Alexa Fluor 594 cabra anti-rato IgG1) | Invitrogen | A21125 | |
Solução de Ringer (2L):
| Todos os reagentes de Fisher Scientific |
|
Referências
- Le Douarin, G., Renaud, D. Morphologic and physiologic study of the differentiation in vitro of quail embryo precardial mesoderm. Bull. Biol. Fr. Belg. 103 (3), 453-468 (1969).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods. Mol. Biol.
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Reimpressões e permissões
