Artigo de método

Em Assembléia in vitro de Semi-artificial máquina molecular e sua utilização para detecção de danos no DNA

DOI:

10.3791/3628

⸱

11 de janeiro de 2012

 , 
1Neurosurgery, Baylor College of Medicine , 2Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 3Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós demonstramos a montagem e aplicação de um dispositivo em escala molecular alimentado por uma proteína topoisomerase. A construção é um sensor de bio-molecular que rotula dois principais tipos de quebras de DNA em cortes de tecido, anexando dois fluoróforos diferentes para os seus fins.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naturalmente bio-molecular máquinas de trabalho em cada célula viva e exibir uma variedade de modelos 06/01. No entanto, o desenvolvimento de centros artificial molecular máquinas em dispositivos capazes de movimento direcional, ou seja, motores moleculares, e sobre a sua escala reduzida partes mecânicas (rodas, eixos, etc pingentes) 7-9. Este imita as máquinas macro-, mesmo que as propriedades físicas essenciais para estes dispositivos, tais como a inércia ea conservação do momento, não são utilizáveis ​​em ambientes nanoworld 10. Projetos alternativos, que não seguem os esquemas mecânicos macromachines e usar mecanismos desenvolvidos na evolução de moléculas biológicas, pode aproveitar as condições específicas do mundo nano. Além disso, adaptando reais de moléculas biológicas para fins de nano-design reduz perigos em potencial dos produtos da nanotecnologia pode representar. Aqui demonstramos a montagem e aplicação de uma construção bio-enabled tais, comoemi-artificial dispositivo molecular que combina uma máquina molecular de ocorrência natural com componentes artificiais. Do ponto de vista enzimologia, a nossa construção é um designer complexo enzima-substrato fluorescente colocados juntos para executar uma função específica útil. Este conjunto é, por definição, uma máquina molecular, uma vez que contém um 12. No entanto, sua integração com a parte de engenharia - hairpin dupla fluorescentes - re-direciona para uma nova tarefa de rotulagem danos no DNA 12.

Nossa construção reúne a partir de um DNA 32-mer e uma enzima topoisomerase I vaccinia (VACC TOPO). A máquina então usa seu próprio material para fabricar duas unidades detector fluorescente etiquetado (Figura 1). Uma das unidades (fluorescência verde) carrega VACC TOPO covalentemente ligado a seu 3'end e outra unidade (fluorescência vermelha) é um hairpin livre com uma 3'OH terminal. As unidades são de curta duração e rapidamente montar de volta para a construção original, que posteriormente recleaves.Na ausência de DNA quebra estas duas unidades separadas de forma contínua e religate de uma forma cíclica. Em cortes de tecidos com danos no DNA, a unidade de transporte de detector topoisomerase seletivamente atribui a quebra ponta e DNA com 5'OH (DNase II tipo-breaks) 11,12, fluorescente rotulá-los. O segundo, hairpin enzima livre formado após clivagem oligonucleotídeo, vai a uma ligadura 5'PO 4 quebrar blunt-ended (DNase I tipo-breaks) 11,12, se ligase T4 DNA está presente na solução 13,14. Quando ligase T4 DNA é adicionado a uma secção de tecido ou uma solução contendo DNA com 4 5'PO ponta e breaks, a ligase reage com 5'PO quatro extremidades do DNA, formando semi-estável da enzima DNA-complexos. Os grampos de cabelo sem corte terminou irá interagir com estes complexos liberando hairpins ligase e covalentemente ligados a DNA, assim rotulagem 5'PO quatro breaks ponta e DNA.

Este desenvolvimento exemplifica uma nova abordagem prática para podesign e de máquinas moleculares e fornece um sensor de útil para a detecção de apoptose e dano de DNA em células fixas e tecidos.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As seções para a detecção baseada em máquina molecular deve ser preparado em primeiro lugar porque a sua preparação leva mais tempo do que a montagem do dispositivo molecular. A construção funciona bem com 5-6μm de espessura, corte de paraformaldeído fixo, blocos de parafina do tecido. Use marcas de slides que retêm seções bem, como ProbeOn Além disso slides carregada e precleaned (Fisher Scientific) ou similar. Recomendamos em primeiro lugar usando um tecido com um padrão conhecido de dano ao DNA, que contém tanto DNase I e tipo II DNase-breaks, como a dexametasona tratadas com ratos apoptóticas timo 13,14.

1. Preparação de seçõ....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste vídeo, demonstramos como montar e usar um dual-rotulagem sensor de danos ao DNA. O sensor é uma máquina molecular impulsionada por bio-molecular do motor, um vírus proteína codificada TOPO VACC ligados com componentes artificiais. O desenvolvimento apresentado exemplifica uma abordagem bio-enabled que defende a adaptação das estruturas biológicas, arquiteturas e peças e componentes reais de células para o projeto de não-tóxico dispositivos à escala molecular 12,15. Esta abordagem resolve duas questões i.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi suportada por subvenção R01NS062842 do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame, National Institutes of Health (VVD) e por doações R21 NS064403 do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame, National Institutes of Health através ARRA (VVD) e R21 EB006301 National Institute of Biomedical Imaging e Bioengenharia, National Institutes of Health (VVD).

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

  1. Xileno
  2. 80 e Etanol a 96%.
  3. Solução 2% de albumina bovina (BSA) em água destilada.
  4. Oligonucleotídeo 1: um grampo duplo, dual marcado com fluoresceína e tetrametilrodamina:

5'-GGA AAG CCT GC F GGT GCA CCC ATT ACG CAT R AT GCG TT-3 '; F - FITC-dT; R - tetrametilrodamina-dT. Outros vermelho deslocado fluoróforos, tais como BODIPY TR, rodamina ou TAMRA pode ser usado em vez de R tetrametilrodamina como.

Alternativamente, você pode usar 2 Oligonucleotide -. Hairpin uma única dupla marcada com fluoresceína (para a detecção de um único tipo de quebras de DNA (DNase II tipo apenas) A sonda single-fluoróforo de transporte é consideravelmente menos caro e é conveniente sempre que um único tipo de quebra de DNA deve ser rotulado: 5'-GGA AAG CCT GC F GGT GCA CCC ATT ACG CAT ATG CGT T-3 '; F - FITC-dT

  1. Oligonucleotídeo 3. Blunt-ended rodamina marcado hairpin para o realce do sinal de ligadura situ com DNA ligase T4: 5'-GCG CTA GAC C G R GTC TAG CGC-3 '; R - tetrametilrodamina-dT
  2. Vaccinia DNA topoisomerase l (VACC TOPO) - 3000 U / mL (Vivid Technologies). Nos experimentos iniciais foram utilizados 215 pmoles (7,1 mg) do TOPO VACC por cada mL 25 da mistura de reacção. No entanto, a concentração topoisomerase pode ser significativamente reduzido sem perda de sensibilidade. Mais tarde, usou uma quantidade quatro vezes menor de VACC TOPO por seção (1,76 g em 25 mL da mistura de reação por seção) com resultados semelhantes. Reduzir a quantidade da enzima a 880 ng (em 25 mL da mistura de reação) resultou em um sinal mais fraco e 8,8 ng de VACC TOPO não produziu nenhum sinal detectável.
  3. DNA ligase T4 5 U / mL (Roche). Esta preparação altamente concentrada ligase dá o melhor sinal em nossas condições experimentais.
  4. 10 x tampão de reação para a T4 DNA ligase: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2, 10 Ditioeritritol mM, 10 mM ATP, pH 7,5 (20 ° C) (Roche). ATP em tampão de reação é facilmente destruído em ciclos repetitivos de descongelamento-congelamento. Alíquota do buffer em pequenas porções 15-20 mL e armazenar a - 20 ° C. Use uma vez.
  5. 30% (w / v) solução de PEG-8000 (Sigma) em água bidestilada. 15% PEG-8000 na mistura de reacção fortemente estimula a detecção, aumentando as concentrações eficazes dos seus constituintes, por exclusão de volume.
  6. Proteinase K (Roche) 20 solução estoque mg / mL em água destilada. Armazenar a - 20 ° C. Na solução use reação 50mg/ml em PBS, preparado a partir do estoque. Não reutilize.
  7. Vectashield com DAPI (Vector Laboratories).
  8. Tampão de bicarbonato de sódio: 50m M NaHCO 3, 15m M NaCl, pH 8,2.
  9. Vidro 22x22mm ou 22x40mm ou lamelas de plástico. Lamínulas de plástico são preferíveis durante a reação, já que umre mais fácil de remover da seção.

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).
  2. Schuldt, A. Dynamic Pol expeditions. Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).
  3. Urry, D. W. Molecular machines: how m....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Montagem de M quinas MolecularesDetec o de Danos ao DNATopoisomerase de VacciniaUnidades de Grampos FluorescentesPrepara o de Cortes TeciduaisDigest o com Proteinase KT4 DNA LigaseQuebras de Extremidades CegasDetec o de ApoptoseSensor de Nanotecnologia

Artigos relacionados