Uma maneira simples, eficiente e robusta para sincronizar a entrega de múltiplos componentes virais para as células vegetais através Agrobacterium Mediada expressão transiente é descrito. Esta abordagem é favorável para estudar a replicação, encapsidação seguido por In vitro Remontagem de componentes não-virais do genoma empobrecido ópticos fantasmas virais adequados para aplicações biomédicas.
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Artigo de método
Simples e robusto In vivo E In vitro Abordagem para o Estudo Assembléia Virus
Neste artigo
Resumo
Resumo
Em vírus com sentido positivo patogênico genomas RNA de seres humanos, animais e plantas, de encapsidação progênie em viriões maduros e estáveis é uma fase cardeal durante o estabelecimento da infecção em um determinado host. Consequentemente, o estudo de encapsidação decifra as informações sobre o know-how do mecanismo de regulação montagem do vírus para formar virions infecciosos. Essa informação é vital na formulação de novos métodos de contenção propagação do vírus e controle da doença. Encapsidação vírus pode ser estudada in vivo e in vitro. Encapsidação Genoma in vivo é um processo altamente regulado seletiva envolvendo interações macromoleculares e compartimentalização subcelular. Portanto, estudar levando a dissecar eventos abrangendo encapsidação vírus in vivo seria fornecer conhecimentos básicos para compreender como os vírus se proliferam e montar. Recentemente, em encapsidação vitro tem sido explorada para a pesquisa na área de biomédica imaging e aplicações terapêuticas. Vírus não-envelopados plantas estão muito à frente no empreendimento de encapsidação em vitro da matéria carregada negativamente estrangeira. Brome vírus do mosaico (BMV), um não encapsulado multicomponente patogenicidade do vírus de RNA para plantas, tem sido utilizado como um sistema modelo para estudar embalagem genoma in vivo e in vitro. Para os ensaios de encapsidação em plantas de Nicotiana benthamiana, mediada por Agrobacterium de expressão transiente, se referem como agroinfiltration, é uma técnica eficiente e fiável para a entrega sincronizado e expressão de componentes múltiplos para a mesma célula. Nesta abordagem, uma suspensão de células de Agrobacterium tumefaciens que transportam binários vectores plasmídicos transportando cDNAs de mRNAs desiredviral é infiltrado no espaço intercelular folha withina usando nada mais sofisticado que uma seringa de 1 ml descartável (sem agulha). Este processo resulta na transferência de inserção de ADN em células vegetais; o T-DNAinserto permanece transientemente no núcleo e, em seguida, é transcrito pelo hospedeiro polimerase II, que conduz à expressão transiente. A transcrição do mRNA resultante (nivelado e poliadenilado) é então exportado para o citoplasma para a tradução. Após aproximadamente 24 a 48 horas de incubação, as secções de folhas infiltradas pode ser amostrada para microscopyor análises bioquímicas. Agroinfiltration permite um grande número (centenas a milhares) de células a serem transfectadas simultaneamente. Para na encapsidação vitro, partículas virais purificadas de BMV são dissociados em proteína da cápside por diálise contra a dissociação de cloreto de cálcio tampão contendo seguido por remoção de RNA e un-dissociados viriões por centrifugação. Genoma empobrecido subunidades da proteína da cápside são reagrupados com desejados componentes do genoma viral ou não virais, tais como componentes indocianina corante.
Protocolo
1. O material vegetal
- Plantas de Nicotiana benthamiana a serem utilizados no ensaio de encapsidação deve estar na fase 4 folhas (plantas semana aproximadamente 3-4 de idade).
2. Entrega e expressão de componentes funcionais do genoma viral para plantar células por agroinfiltration
- Dia 1: A estirpe de Agrobacterium (por exemplo, EH 105 ou GV 3101) abrigando o RNA pCass-BMV 1, BMV RNA 2 e 3 BMV RNA 1,2 são cultivadas em placas de LB agar suplementado com 50 mg / ml de canamicina (selecciona para o vetor pCASS) e 100mg/ml de rifampicina (seleciona para o Agrobacterium). A incub....
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Discussão
Abordagem Agroinfiltration aqui apresentadas podem ser amplamente aplicável a uma ampla gama de vírus de plantas. Uma característica marca desta abordagem é sincronizado entrega de agroconstruct múltipla para a célula-a mesma desvantagem importante geralmente associado com rotineiramente utilizado inoculação mecânica de vírus de plantas. In vivo e in vitro de montagem, utilizando brome vírus do mosaico como um modelo pode ser conduzida de forma eficiente pela a seguir algumas dicas. (i) para a infiltra.......
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a vários membros do laboratório para as suas sugestões valiosas para o desenvolvimento de agroinfiltration e em ensaios in vitro de montagem. Este trabalho foi financiado por uma bolsa da Universidade da Califórnia. Este estudo foi financiado em partes por uma concessão do National Science Foundation (CBET-1144237).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de Catálogo | |
| Sódio sais MES | Sigma-Aldrich | M2993 | |
| Indocianina verde | Sigma-Aldrich | I2633 | |
| Ultracentrífuga Beckman | Beckman Coulter | Modelo: L8-70M | |
| Centricon-100 coluna | Millipore | YM-100 | |
| Espectrofotômetro | Cary 50, Varian Inc. | Número da peça 10068900 | |
| Espectrofluorímetro | Fluorolog 3, Jobin-Yvon. | Número da peça FL3-21 |
Referências
- Annamalai, P., Rao, A. L. Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging. Virology. 338, 96-111 (2005).
- Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L.
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Reimpressões e permissões
