Este método descreve a síntese in vitro com alto rendimento de RNA mensageiro (mRNA) tanto com capuz quanto sem capuz, a partir de um plasmídeo linearizado contendo o gene da luciferase de Gaussia (GLuc). O RNA é purificado e uma fração do RNA sem capuz é cappingada enzimaticamente utilizando a enzima de capping do vírus Vaccinia. Na etapa final, o mRNA é transfetado em células HeLa e os sobrenadantes do cultivo celular são analisados quanto à atividade da luciferase.
Artigo de método
Transcrição in vitro e nivelamento de Gaussia mRNA luciferase Seguido por HeLa transfecção celular
Neste artigo
Resumo
Resumo
A transcrição in vitro é a síntese de transcritos de RNA pela RNA polimerase a partir de um molde de DNA linear contendo a sequência correspondente do promotor (T7, T3, SP6) e o gene a ser transcrito (Figura 1A). Uma reação típica de transcrição consiste no molde de DNA, RNA polimerase, trifosfatos de ribonucleotídeos, inibidor de RNase e tampão contendo íons Mg2+.
Grandes quantidades de RNA de alta qualidade são frequentemente necessárias para diversas aplicações. O uso da transcrição in vitro tem sido descrito em estudos de estrutura e função do RNA, como no processamento do RNA mensageiro1, experimentos de RNA interferente em células de mamíferos2, amplificação de RNA antissenso pelo "método Eberwine"3, análise por microarranjo4 e em estudos de vacinas baseadas em RNA5. A técnica também pode ser utilizada para produzir sondas marcadas com radioisótopos ou com corantes fluoroforos6. Warren, et al. relataram recentemente a reprogramação de células humanas por meio da transfeção com RNA com capa 5' produzido por transcrição in vitro7. O Kit de Síntese de RNA de Alto Rendimento T7 da New England Biolabs foi desenvolvido para sintetizar até 180 μg de RNA por reação de 20 μl. RNA com comprimento de até 10 kb já foi transcrito com sucesso utilizando este kit. DNA plasmidial linearizado, produtos de PCR e oligonucleotídeos de DNA sintéticos podem ser usados como molde para a transcrição, desde que contenham a sequência do promotor T7 localizada a montante do gene a ser transcrito.
A adição de uma estrutura de capa na extremidade 5' do RNA é um processo importante em eucariotos. É essencial para a estabilidade do RNA8, tradução eficiente9, transporte nuclear10 e splicing11. O processo envolve a adição de uma capa de 7-metilguanosina na extremidade com trifosfato 5' do RNA. A capagem do RNA pode ser realizada pós-transcricionalmente usando enzimas de capagem ou co-transcricionalmente usando análogos de capa. No método enzimático, o mRNA é cappingado usando a enzima de capagem do vírus da Vaccinia12,13. A enzima adiciona uma capa de 7-metilguanosina na extremidade 5' do RNA, utilizando GTP e S-adenosil metionina como doadores (estrutura cap 0). Ambos os métodos produzem RNA cappingado funcionalmente ativo, adequado para transfeção ou outras aplicações14, como a geração de RNA genômico viral para sistemas de genética reversa15 e estudos cristalográficos de proteínas ligadoras de capa, como a eIF4E16.
No método descrito abaixo, o Kit de Síntese de RNA de Alta Produtividade T7 da NEB é utilizado para sintetizar transcritos de RNA com e sem capuz de luciferase de Gaussia (GLuc) e luciferase de Cypridina (CLuc). Uma porção do RNA de GLuc sem capuz é cappingada usando o Sistema de Capping Vaccinia (NEB). Um plasmídeo linearizado contendo o gene de GLuc ou CLuc e o promotor T7 é usado como DNA molde. O RNA transcrito é transfectado em células HeLa e os sobrenadantes do cultivo celular são analisados quanto à atividade de luciferase. O RNA de CLuc com capuz é utilizado como controle interno para normalizar a expressão de GLuc.
Protocolo
As RNases estão comumente presentes na pele, cabelo, poeira, superfícies de laboratório, soluções, etc. Use luvas e limpe a superfície da bancada, pipetas, etc. cuidadosamente antes do uso para evitar contaminação por RNases. Recomenda-se fortemente o uso de ponteiras, tubos, vidraria e reagentes livres de nucleases.
1. Transcrição in vitro utilizando o Kit T7 High-yield RNA Synthesis
O modelo de DNA para a reação de transcrição é um plasmídeo linearizado contendo o gene da luciferase de Gaussia e um promotor T7 acima da sequência codificadora (Figura 1B).
- Descongele os componentes do kit T7 High Yield RNA Synthesis e mantenha-os no gelo.
- Para RNA sem capuz, monte a reação à temperatura ambiente na seguinte ordem:
| Componente | Volume (μl) | Final |
| Água livre de nucleases* | X | |
| Tampão de Reação 10X | 2 | 1X |
| ATP (100 mM) | 2 | 10mM |
| CTP (100 mM) | 2 | 10mM |
| UTP (100 mM) | 2 | 10mM |
| GTP (100 mM) | 2 | 10mM |
| ADN molde* | X | 1 μg |
| Mistura de T7 RNA Polimerase | 2 | |
| Total | 20 |
*Adicione 1 μg de DNA e complete o volume total da reação até 20 μl com água livre de nucleases. A quantidade de água a ser adicionada variará conforme a concentração do DNA molde.
- Para RNA com cap: Monte a reação à temperatura ambiente na seguinte ordem:
| Componente | Volume (μl) | Final |
| Água livre de nucleases* | X | |
| Tampão de reação 10X | 2 | 1X |
| ATP (100 mM) | 2 | 10mM |
| CTP (100 mM) | 2 | 10mM |
| UTP (100 mM) | 2 | 10mM |
| GTP (20 mM) | 2 | 2mM |
| Análogo de cap 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G (ARCA) (40mM) | 4 | 8mM |
| ADN molde* | X | 1 μg |
| Mistura de T7 RNA polimerase | 2 | |
| Total | 20 |
*Adicione 1 μg de DNA e complete o volume final da reação até 20 μl com água livre de nucleases. A quantidade de água a ser adicionada variará conforme a concentração do DNA molde.
- Agite bem em vórtex e incube as reações a 37 °C por 2 horas em uma estufa de ar seco.
- Siga os passos 1.3-1.4 para sintetizar transcritos com capuz da luciferase de Cypridina (CLuc) a partir de um plasmídeo linearizado contendo o gene CLuc. Este mRNA será co-transfectado com o mRNA de GLuc com e sem capuz para normalização da expressão de GLuc.
2. Remoção do DNA do Molde
As reações de transcrição são tratadas com DNase I para remover o molde de DNA antes de prosseguir com a purificação.
- Adicione 70 μl de água livre de nucleases às reações de transcrição, seguidos por 10 μl de tampão de reação da DNase I.
- Adicione 2 μl de DNase I às reações.
- Incube a 37 °C por 15 minutos em uma estufa de ar seco.
3. Purificação por Coluna de RNA com Capa e sem Capa
- Purifique o RNA com capa e sem capa utilizando o MEGAclearKit conforme as instruções do fabricante (pode ser usado qualquer kit de purificação de RNA baseado em coluna de centrifugação).
- Quantifique o RNA utilizando um espectrofotômetro NanoDrop.
- Conforme as instruções do fabricante, avalie a qualidade da amostra de RNA utilizando o Agilent RNA 6000 Nano Kit e o Agilent 2100 Bioanalyzer.
4. Capeamento de RNA utilizando o Sistema de Capeamento Vaccinia
- Utilize 10 μg do mRNA de GLuc purificado e sem capuz.
Uma reação padrão de capping pode adicionar cap em até 10 μg de RNA (100 nt ou maior). Se for necessário adicionar cap em uma quantidade maior de RNA, a reação pode ser proporcionalmente ampliada.
- Aumentar o volume para 15 μL usando água livre de nucleases.
- Incubar o RNA a 65 °C por 10 minutos para remover estruturas secundárias. Colocar no gelo por 5 minutos.
- Para montar a reação de capping, adicionar 2 μL de Capping Buffer 10X, 1 μL de GTP (10 mM), 1 μL de S-adenosil metionina recém-diluída (2 mM) e 1 μL (10 unidades) de enzima de capping da vacínia ao RNA desnaturado de 15 μL.
- Homogeneizar bem por vortexagem suave e incubar a reação a 37 °C por 30 minutos em uma incubadora de ar seco.
5. Purificação por Coluna do RNA Capped
- Purifique o RNA com capa usando o Kit MEGAclear (qualquer kit de purificação de RNA baseado em coluna de centrifugação pode ser utilizado).
- De acordo com as instruções do fabricante, avalie a qualidade da amostra de RNA utilizando o Kit Agilent RNA 6000 Nano e o Agilent 2100 Bioanalyzer.
6. Transfecção de Células HeLa utilizando o Kit de Transfecção de mRNA TransIT
- Plaque células HeLa em uma placa de 48 poços com 150 μl de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), alto teor de glicose, suplementado com 10% de soro bovino fetal (0,7-2,3 × 105 células/poço).
- Incube por 16-24 horas a 37 °C para que as células atinjam 60-90% de confluência.
- Dilua o RNA de GLuc (com capa e sem capa) e de CLuc até a concentração de 100 ng/μl.
Cada transfeção é realizada em replicatas de 8.
- Preparar 8 tubos eppendorf tubos. A cada tubo adicione 1 μl RNA de GLuc sem cap 1 μl RNA CLuc com cap (para normalização) e 25 μl de DMEM sem soro. Misture bem.
- Prepare 8 tubos eppendorf. Adicione a cada tubo 1 μl RNA GLuc com cap (análogo de cap) 1 μl RNA CLuc com cap (para normalização) e 25 μl de DMEM sem soro. Misture bem.
- Prepare 8 tubos eppendorf. Adicione a cada tubo 1 μl RNA GLuc com capVaccinia), 1 μl RNA CLuc com cap (para normalização) e 25 μl de DMEM sem soro. Misture bem.
- Adicione 0.2 μl Reagente de Reforço de mRNA ao primeiro conjunto de 8 tubos e misture.
- Adicione 0.2 μl TransReagente de mRNA de IT para o primeiro conjunto de 8 tubos e misture.
- Incubar à temperatura ambiente por 2 a 5 minutos. (Não incubar por mais de 5 minutos).
- Adicione a mistura de transfeção gota a gota aos poços contendo culturas de células HeLa (consulte Figura 3 para a configuração da placa).
- Repita os passos de 7 a 10 com o 2nd e 3rd conjuntos de 8 tubos.
- Incubar durante a noite (16 horas) a 37 °C em 5% CO2.
7. Ensaio de Luciferase de Gaussia (GLuc)
Dosar o sobrenadante de cada poço quanto à atividade de GLuc utilizando o kit BioLux Gaussia Luciferase Assay Kit conforme a seguir:
- Prepare a solução do ensaio fresca adicionando 15 μl do Substrato BioLux GLuc a 1,5 ml do Tampão de Ensaio BioLux GLuc (são necessários 50 μl de solução de ensaio por amostra). Prepare quantidade suficiente para as amostras e para a escorva do injetor do luminômetro (consulte as instruções do fabricante).
- Agite bem invertendo o tubo várias vezes (não vortex).
A luminescência é medida utilizando o luminômetro de microplacas Centro LB 960 da Berthold Technologies.
- Configure o luminômetro para um volume de injeção de 50 μl e integração de 2-10 segundos.
- Adicione 10 μl do sobrenadante do cultivo celular de cada poço em uma placa preta de 96 poços.
- Primingue o injetor com a solução do ensaio e prossiga com a medição da luminiscência.
- Os valores obtidos dos poços não transfectados serão utilizados como controles negativos.
8. Ensaio de Luciferase de Cypridina (CLuc)
Dosar o sobrenadante de cada poço para atividade de CLuc utilizando o kit de ensaio de luciferase BioLux Cypridina da seguinte forma:
- Prepare o substrato recém-reconstituído (100x) de acordo com as instruções fornecidas no manual do kit.
- Descongele o BioLux Cypridina Luciferase Assay Buffer e misture bem (proteja da luz).
- Para preparar a solução do ensaio CLuc, adicione 15 μl do substrato reconstituído (100x) a 1,5 ml do BioLux Cypridina Luciferase Assay Buffer (são necessários 50 μl de solução de ensaio por amostra). Prepare quantidade suficiente para as amostras e para a cebagem do injetor do luminômetro (consulte as instruções do fabricante).
- Misture bem invertendo o tubo várias vezes (não vortex).
- Mantenha a solução em temperatura ambiente por 30 minutos (proteja da luz).
A luminiscência é medida utilizando o luminômetro de microplacas Centro LB 960 da Berthold Technologies.
- Configure o luminômetro para injeção de 50 μl, com atraso de 1-2 segundos e integração de 2-10 segundos.
- Adicione 10 μl do sobrenadante do cultivo celular de cada poço em uma placa preta de 96 poços.
- Primingue o injetor com a solução do ensaio CLuc e meça a luminiscência.
- Os valores obtidos dos poços não transfectados serão utilizados como controles negativos.
9. Resultados Representativos
O Kit de Síntese de RNA de Alto Rendimento T7 pode produzir até 180 μg de RNA sem capuz e de 40 a 50 μg de RNA com capuz por reação de 20 μl. Quando analisado no Agilent 2100 Bioanalyzer, o RNA íntegro e de boa qualidade deve apresentar um único pico acentuado, representando o transcrito de RNA. Um pico amplo ou múltiplos picos indicam degradação do RNA. Também é importante verificar o tamanho do RNA. Transcritos de RNA mais longos do que o esperado podem ser devidos à digestão incompleta do DNA plasmidial do molde. A degradação do RNA e o menor rendimento geralmente são resultado de contaminantes introduzidos na reação a partir do DNA molde. Figura 2 é um exemplo do eletroferograma e da imagem do gel obtidos após a análise de RNA íntegro e de alta qualidade no Bioanalyzer.
A transfeção de células HeLa com RNA GLuc recoberto e não recoberto é seguida por incubação e ensaio dos sobrenadantes de cultura celular para atividade de luciferase. A estrutura do cap 5' é importante para proteger o RNA contra a degradação por exonuclease8 e para promover a iniciação da tradução9 do mRNA. Portanto, o recobrimento do RNA é uma etapa essencial para experimentos de transfeção. O método co-transcricional (análogo do cap) produz aproximadamente 40 μg de RNA com 80% de recobrimento. O protocolo que utiliza a enzima de recobrimento da vacínia recobre até 10 μg de RNA (100 nt ou maior) por reação com eficiência quase de 100%.
Figura 4 mostra a diferença na expressão de luciferase entre culturas transfetadas com amostras de RNA com capuz e sem capuz. Pode-se observar claramente que as culturas celulares transfetadas com RNA com capuz apresentam expressão muito maior de luciferase em comparação com aquelas transfetadas com RNA sem capuz (que não mostram atividade de luciferase). Além disso, Figura 4 também valida que ambas as técnicas de capilarização, utilizando análogo de capuz e utilizando a enzima de capilarização da Vacínia, produzem com sucesso transcritos de RNA funcionais e com capuz que podem ser traduzidos em proteína. O valor de p bicaudal obtido a partir do teste t foi de 0,2583, o que indica que não há diferença estatística significativa entre os dados de luminescência dos dois métodos de capilarização.
Figura 1A. Síntese de RNA pela Polimerase de RNA T7
Figura 1B. Vetor pCMV-GLuc contendo o gene GLuc e o promotor T7.
Figura 2. Eletroferogramas do Bioanalyzer e imagem em gel de RNA com capuz e sem capuz. O eixo X representa o tamanho do RNA em nucleotídeos (nt) e o eixo Y representa unidades de fluorescência (FU). A) Eletroferograma de mRNA GLuc (sem capuz) após purificação. B) Eletroferograma de mRNA GLuc (com capuz utilizando a enzima de capuzamento Vaccinia). C) Eletroferograma de mRNA GLuc (com capuz co-transcricionalmente utilizando análogo de capuz). D) Imagem semelhante a gel gerada pelo Bioanalyzer. A linha 'L' é a escada de RNA, a linha 1 é o mRNA GLuc sem capuz, a linha 2 é o mRNA GLuc com capuz utilizando o análogo de capuz e a linha 3 é o RNA GLuc com capuz utilizando a enzima de capuzamento Vaccinia.
Figura 3. Exemplo de configuração da placa para transfeção de células HeLa. Cada poço contém células HeLa semeadas com confluência entre 60-90%. A mistura de transfeção, composta pelo RNA apropriado de GLuc (sem capuz, com capuz usando análogo de capuz ou com capuz com enzima de capuz da Vaccinia), RNA de CLuc com capuz (para normalização), Reagente mRNA Boost e Reagente TransIT mRNA, é adicionada a cada poço. Cada transfeção é realizada em oito réplicas (poços da mesma cor na figura).
Figura 4.Expressão de GLuc em células HeLa. mRNA GLuc purificado com capa e sem capa foi transfetado em células HeLa e incubado durante a noite (16 horas) a 37 °C. Os sobrenadantes do cultivo celular de cada poço foram analisados quanto à atividade de GLuc e CLuc, e os valores de luminiscência foram registrados. Os valores de luminiscência de GLuc foram normalizados aos valores de luminiscência de RNA CLuc com capa.
* A luminiscência de células não transfectadas foi subtraída dos valores de GLuc e CLuc antes da normalização.
Marcas registradas
BioLux é uma marca registrada da New England Biolabs, Inc.
TransIT é uma marca registrada da Mirus Bio LLC.
MEGAclear é uma marca registrada da Ambion.
Discussão
A transcrição in vitro é um método útil para obter altos rendimentos de RNA para diversas aplicações. A principal vantagem do uso do Kit de Síntese de RNA de Alto Rendimento T7 é que sua formulação foi otimizada para alcançar altos rendimentos de RNA. Além disso, os reagentes fornecidos no kit são livres de nucleases contaminantes, resultando na síntese de transcritos de RNA de alta qualidade e intactos. O kit foi projetado para alta estabilidade e flexibilidade, podendo ser usado para a síntese de mRNA, RNA marcado com corante, sondas radiomarcadas de alta atividade específica e RNA com capuz. O manual do kit inclui uma lista de protocolos específicos e materiais adicionais necessários para cada uma dessas aplicações. Também contém informações técnicas sobre o uso de produtos de PCR e oligonucleotídeos de DNA sintéticos como modelos para transcrição. É importante observar que o kit de transcrição só pode utilizar modelos de DNA contendo um promotor T7.
O método descrito neste artigo demonstra a adição pós-transcricional de cap em RNA utilizando a enzima de capping da Vacinia, bem como a adição co-transcricional de cap utilizando análogo da estrutura de cap do RNA. Demonstramos que ambos os métodos sintetizam RNA com cap funcionalmente ativo após transfeção. A estrutura do cap 5' melhora a estabilidade do RNA e a eficiência de tradução, sendo, portanto, importante para experimentos de microinjeção11 e transfeção7. O método de capping co-transcricional gera 40-50 μg de RNA com cerca de 80% de cap. É importante observar que o uso do análogo de cap ARCA (3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G), que possui o grupo hidroxila 3' bloqueado no m7G, assegura a incorporação do cap na orientação correta17. Para obter maiores quantidades de RNA com cap, é possível ampliar as reações-padrão para ambos os métodos de capping. No entanto, o uso do Sistema de Capping da Vacinia seria uma opção mais viável em termos de custo, já que o capping co-transcricional utiliza análogo de cap, um componente relativamente caro. O Sistema de Capping da Vacinia também é um método superior, pois apresenta eficiência de capping de quase 100%.
Os métodos de capping de RNA descritos acima sintetizam RNA com uma estrutura de cap 0 na extremidade 5'. A estrutura cap 1 envolve uma metilação adicional na posição 2'-O da ribose do primeiro nucleotídeo na extremidade 5' do RNA. Relatou-se que a estrutura cap 1 aumenta a eficiência de tradução do RNA18 e pode ser incorporada utilizando 2'-O-metiltransferase20, 21.
O método descrito neste artigo pode ser usado para transcrever, adicionar capuz e transfectar qualquer mRNA desejado. As luciferases GLuc e CLuc foram especificamente utilizadas neste protocolo devido às suas diversas vantagens. Elas são diretamente secretadas no meio celular, evitando assim a necessidade de lise celular. Além disso, geram alta intensidade de sinal bioluminescente, e os ensaios de atividade são altamente sensíveis e fáceis de realizar. É importante observar que a expressão de GLuc nas células pode ser influenciada por diversos fatores além da funcionalidade do próprio RNA. Alguns exemplos são erros de pipetagem, número variável de células por poço, eficiência de transfeção, etc. A normalização dos dados é utilizada para levar em conta esses fatores. Em nosso protocolo, co-transfectamos RNA de CLuc como controle interno juntamente com o RNA de GLuc. Quando a luminescência de GLuc é dividida pelos valores de controle de CLuc, ela é normalizada em relação aos erros e à variabilidade na transfeção19.
Divulgações
Todos os autores são funcionários da New England Biolabs, Inc.
Agradecimentos
Dongxian Yue, Brett Robb, George Tzertzinis, Tanya Bhatia, Breton Hornblower.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de Síntese de RNA com Alta Produtividade T7 | New England Biolabs | E2040S | |
| 3’-0-Me-m7G(5’)ppp(5’Estrutura análoga ao cap de RNA | New England Biolabs | S1411S | |
| DNase I (livre de RNase) | New England Biolabs | M0303S | |
| Sistema de Capeamento por Vaccinia | New England Biolabs | M2080S | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| NanoDrop Espectrofotômetro | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| TransKit de Transfecção de mRNA de IT | Mirus Bio LLC | MIR2250 | |
| HyClone* Meios Líquidos Clássicos: Dulbecco’s Eagle Modificado’meio s, glicose alta | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30285.01 | |
| HyClone Aminoácidos Não Essenciais | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30238.01 | |
| Centro LB 960 | Berthold Technologies | ||
| BioLux Gaussia Kit de Ensaio de Luciferase | New England Biolabs | E3300S | |
| BioLux Cypridina Kit de Ensaio de Luciferase | New England Biolabs | E3309S | |
| Inibidor de RNase, Murino | New England Biolabs | M0314 | |
| Inibidor de RNase, Placenta Humana | New England Biolabs | M0307 | |
| pCMV-GLuc Plasmídeo Controle | New England Biolabs | N8081 |
Referências
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Reimpressões e permissões
