Aqui demonstramos nosso protocolo para isolamento de células basais e das glândulas submucosas duto de traqueias de rato. Nós também demonstram o método de injecção de células estaminais na almofada de gordura dorsal do rato para criar um In vivo Modelo de regeneração da glândula submucosa.
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Artigo de método
Isolamento de células basais e células Duct submucosa Glândulas de Rato Traquéia
Neste artigo
Resumo
Resumo
Grandes vias aéreas estão diretamente em contato com o meio ambiente e, portanto, suscetível a lesões de toxinas e agentes infecciosos que respiramos em 1. Grandes vias aéreas, portanto, exigem um mecanismo de reparo eficiente para proteger os nossos corpos. Este processo de reparo ocorre a partir de células-tronco nas vias aéreas e isolar essas células-tronco das vias aéreas é importante para compreender os mecanismos de reparo e regeneração. Também é importante para a compreensão de reparação anormal que pode conduzir a doenças das vias aéreas 2. O objectivo deste método é para isolar uma população de células estaminais a partir de novo os ratos ductos de glândulas submucosas traqueal e para colocar estas células in vitro e em sistemas de modelos in vivo para identificar os mecanismos de reparação e regeneração das glândulas submucosas 3. Isto mostra a produção de métodos que podem ser utilizados para isolar e ensaio das células estaminais e do ducto basal das vias aéreas grandes 3. Isto permitirápara o estudo de doenças das vias respiratórias, como a fibrose cística, asma e doença pulmonar obstrutiva crónica. Actualmente, não existem métodos para o isolamento de células das glândulas submucosas duto e não existem modelos in vivo para estudar a regeneração de glândulas submucosas.
Protocolo
Esboço de Passos
1. Dissecção da traquéia
2. Limpeza traquéia e cortá-lo
3. Digestão enzimática e transformação em suspensão de célula única
4. A coloração por FACS e triagem
5. Processamento de células classificadas para in vivo e in vitro, em modelos
1. Dissecção da traquéia
- Euthanize o rato com uma injeção intraperitoneal de 0,1 cc mg/0.2 de pentobarbital.
- Cortar abrir a parede abdominal, e mover os intestinos para o lado a exposição da aorta abdominal e dep....
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Discussão
Esta técnica para isolar as células do ducto e basal das vias aéreas é importante para melhorar a compreensão de reparação e regeneração das vias aéreas e de doenças das vias respiratórias. As técnicas descritas aqui incluem alguns passos críticos. O primeiro é o período de digestão enzimática optimizado. A segunda é a criação de uma suspensão de células individuais através de passagens em série com agulhas calibre progressivamente mais elevadas para impedir ruptura da célula, mas a romper-se grumos celulares. A terceir.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Gostaríamos de reconhecer as grandes Stem Cell FACS Centro de Pesquisa e agradecer especialmente Jessica Scholes e Felicia Codrea por sua ajuda com a classificação celular. O trabalho foi financiado pelo CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, da American Thoracic Society / Fundação DPOC ATS-06-065, A Fundação preocupação, a UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Thoracic Oncology SPORE Cancer Program / Pulmão, da Universidade da Califórnia do Câncer Pesquisa Comissão de Coordenação e Gwynne Hazen cereja Memorial Laboratories (BG).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| Conclua médio 10: DMEM-F-12, 50/50, 1X) | Mediatech | 15-090 CV- | |
| Hepes (15 mM) | Invitrogen | 15630 | |
| Bicarbonato de sódio (3,6 mM ou 0,03%) | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamina (4 mM) | Mediatech | 25-005 Cl- | |
| Penicilina (100 U / ml) | Mediatech | 30-001 CI- | |
| Estreptomicina (100 ug / m) | Mediatech | 30-001 CI- | |
| Anfotericina B (0,25 ug / ml) | Lonza | 17-836R | |
| EmSulin (10 ug / ml) | Sigma | I6634 | |
| Transferrina (5 ug / ml) | Sigma | T1147 | |
| Toxina da cólera (0,1 ng / ml) | Sigma | C8052 | |
| Factor de Crescimento Epidérmico (25 ng / ml) | BD | 354001 | |
| Extrato de Pituitária Bovina (30 ug / ml) | Invitrogen | 13028-014 | |
| O soro de bovino fetal (5%) | Pescador | SH3008803HI | |
| Ácido retinóico (0,05 uM) | Sigma | R2625 | |
| Fator de Crescimento reduzido Matrigel | BD | 354230 |
Tabela 1. Conclua componentes de mídia.
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pronase | Roche | 10165921001 | Usado em 0,15%: -O / n a 4 ° C para isolar a digestão total de células para a cultura de traqueia (ALI) Digestão hr -4 4 ° C para isolar SMG |
| Dispase | BD Biosciences | 354235 | Usado menos 16 Unidades: 30 min à TA |
| DNase I | Sigma | DN25 | Utilizada a 0,5 mg / ml: 20-30 min à temperatura ambiente |
Enzimas Tabela 2. Usado para a digestão enzimática da traqueia.
Referências
- Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. Innate immune functions of the airway epithelium. Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).
- Finkbeiner, W. E. Physiology and pathology of tracheobronchial glands. Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).
- Hegab, A. E.
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Reimpressões e permissões
