O objetivo geral deste vídeo é mostrar como executar alvo injeção de retina e In ovo Electroporação de ADN / ARN construtos dentro da retina de pinto embrionário no Hamburger e do estágio Hamilton 22-23, o que é de cerca de dia embrionário 4 (E4). Esta técnica é muito útil para estudar a expressão do gene, regulação do gene, e mudança morfológica no desenvolvimento de retina do pintinho.
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Artigo de método
Em Eletroporação Ovo na retina de pinto embrionário
Neste artigo
Resumo
Resumo
Retina embrionária de galinha é uma excelente ferramenta para estudar o desenvolvimento da retina em vertebrados mais elevados. Por causa de grande tamanho e desenvolvimento externo, ele é comparativamente muito fácil de manipular a retina de pinto embrionário usando recombinante DNA / tecnologia de RNA. Electroporação de ADN / ARN construtos para a retina embrionária têm uma grande vantagem para estudar regulação do gene em retinianas-tronco / progenitoras células durante o desenvolvimento da retina. Tipo diferente de ensaios, tais como ensaio de repórter gene, gene over-expressão, gene knock down (shRNA), etc pode ser realizada utilizando a técnica de electroporação. Este vídeo demonstra alvejado injecção da retina e em eletroporação in ovo dentro da retina de pinto embrionário no Hamburger e do estágio Hamilton 22-23, o que é de cerca de dia embrionário 4 (E4). Aqui nós mostramos uma rápida e conveniente em técnica de eletroporação in ovo através do qual um DNA de plasmídeo que expressa a proteína fluorescente verde (GFP) como um marcador está diretamente entregue napinto espaço sub-retiniano embrionário e seguido por pulsos elétricos para facilitar a absorção de DNA por retina estaminais / progenitoras das células. O novo método de injecção de retina e electroporação em E4 permite a visualização de todos os tipos celulares da retina, incluindo a neurônios tardia-nascido 1, que tem sido difícil com o método convencional da injecção e electroporação em E1.5 2.
Protocolo
Uma vez que algumas partes do protocolo são realizados conforme descrito anteriormente em outros vídeos Jové 2 e papéis 3 com modificações menores não vamos discutir aqueles em detalhe aqui.
1. Manuseio de ovo e Preparação Agulha
- Os ovos podem ser armazenados em um refrigerador de vinho menos cerca de 13 ° C por até 1 semana. Se a temperatura é demasiado elevada, os embriões vai começar a desenvolver de forma anormal, enquanto que, baixa temperatura provoca uma mortalidade de alta. Quando estiver pronto para incubar tirar os ovos do refrigerador de vinho e definir os ovos na vertical com a extremidade maior até. Mantenha os ovos em a temperatura da sala durante pelo menos 2 horas antes de colocá-los no 37,5 ° C incubadora.
- Incubam os ovos para 96-100 horas, que é sobre o dia embrionário 4 para obter embriões que estão na fase Hamburger e Hamilton 22 4-5.
- Prepare agulhas micropipeta de tubos de vidro puxado capilares e quebrar a ponta em uma micro dissecaçãoescopo com uma pinça para conseguir uma abertura cerca de 0,1 m de diâmetro e um cone de 20 mm. Agulhas com pontas maiores têm dificuldade perfurar a membrana vitelina enquanto pontas menores têm dificuldade de carregar e entregar a solução de DNA.
- Anexar a agulha para um 0,1 ml Hamilton estanque ao gás seringa montada sobre um micromanipulador. Use um pequeno pedaço de Masterplex tubo de silicone para anexar a agulha para a seringa. Uma vez que as conexões estão apertadas não há necessidade de adicionar óleo mineral para selar este anexo.
- Misture 2 uL de repórter solução de ADN plasmídeo com uma concentração que varia 3-6 ug / uL e 0,2 uL de verde rápido (0,025%) em um pedaço de parafilme. Corante verde rápido vai ajudar a visualizar a injeção. Lentamente, carregar a agulha com a mistura.
- Para liberar a membrana vitelina da membrana interna girar o ovo suavemente cerca de 180 ° e esperar por alguns minutos, em seguida, gire-o de volta à posição original e configurá-lo para eletroporação.
- Limpe a forceps e casca de ovo com etanol a 70% para evitar a infecção para o embrião.
- Faça um pequeno buraco sobre o ovo imediatamente acima da célula de ar com um par de fórceps tamanho AA. Tenha cuidado para não quebrar a casca do ovo. Remover pedaços pequenos um de cada vez para fazer uma pequena janela. Cuidadosamente remova a membrana interna usando os fórceps sem tocar a membrana vitelina.
2. Injeção e Eletroporação
- Para evitar danos para o cérebro ou o coração posição, o contra-agulha lateral para o bundle principal de vasos sanguíneos que entram no olho e apontando em direção ao bico.
- Pierce através da membrana vitelina, esclera, retina e humor vítreo por um impulso súbito suave da agulha. Se a agulha perfura através de a outra extremidade do olho que deve ser alright, a menos que ele danifica qualquer veia sangue major.
- Lentamente, puxe de volta a agulha na borda da abertura e colocá-lo quase tangente à parede exterior do globo ocular.
- Insert a agulha para dentro do espaço sub da retina entre a esclera e da retina.
- Injectar o DNA até que você possa visualizar a solução verde de enchimento o lado do globo ocular e empurrando a fressura da retina através da criação de um bojo.
- Se a sua colocação da agulha não é correto, então você vai ver a solução de DNA se espalhando dentro do humor vítreo enchendo até o meio do globo ocular. Além disso, se você danificar a retina muito, então você vai ver a solução de DNA está saindo do globo ocular.
- Lentamente, retirar a agulha e coloque imediatamente os eletrodos em paralelo dentro do ovo após imersão em PBS. Empurre os eletrodos para submergir no líquido amniótico de uma forma para que o olho injetado está localizado entre os eletrodos. Evite tocar em qualquer grande vaso sanguíneo ou o coração com os eletrodos, enquanto colocá-los. O eletrodo negativo deve ser na parte lateral da injecção para que o DNA pode ser transportados a partir do espaço da retina sub para a retina em direção eletrodo positivo. Electrocorporar a retina com 5 pulsos de 15V para 50 ms com intervalos de 950 ms.
- Com cuidado, retire os eletrodos e selar a janela do ovo com pedaços de fita adesiva transparente.
- Etiqueta e datar o ovo injetado antes de colocá-lo de volta para a incubadora. Tipicamente, ele leva cerca de 3 a 5 minutos para completar o processo de electroporação todo.
- Expressão da GFP pode ser visto tão cedo quanto 8 horas após a electroporação. No entanto, você pode esperar até que o embrião atinge a fase desejada antes da colheita.
3. Os resultados representativos
Em nosso estudo, nós usamos vários construtos plasmídicos para estudar a regulação da expressão de gene que envolveu o desenvolvimento de células de retina. Neste vídeo pCAG-GFP (controle de transfecção) foi usado para siga uma injecção de bem-sucedida e electroporação. No entanto, qualquer constructo plasmídeo com gene repórter (GFP, RFP etc) pode ser usado. Mesmo embora expressão da GFP pode ser visto tão cedo quanto 8 horas após a elemenctroporation, que normalmente começar a colher o óvulo no dia 6 (E6) e em diante. Eletroporados retinas foram dissecadas para fora do embrião e analisados em microscópio fluorescente dissecção antes de incorporação e de corte. Tipicamente, expressão do gene repórter pode ser visto, pelo menos, em um quarto da retina após uma electroporação bem-sucedida (Fig. 1). Os tecidos da retina transfectadas foram analisados por meio de seccionamento de uma clara visualização de morfologias celulares. A imuno-histoquímica utilizando marcadores de células tipo específico (Brn3a, Pax6 etc) de caracterização permitido de célula-específica expressão da GFP (Fig 2).
Figura 1. Eletroporação sucesso de expressão plasmídeo repórter GFP resultados positivos. Chicken embrionário retinas foram injetados e electroporados no dia embrionário 4 e colhidas no dia embrionário 6. , Pelo menos, 25% da retina com êxito foi transfectado (Um modo de exibição = Top, B= View Inferior). Escala Bar = 1mm.
Figura 2. Caracterização de células da retina expressando GFP utilizando imuno-histoquímica. GFP expressar tecidos da retina em E7 foram palco fixo e seccionados. Estas secções foram, então, corados com marcadores de células vários específicas. Brn3a foi utilizado para determinar células ganglionares (A) enquanto Pax6 foi utilizado para determinar amacrina, horizontal e células ganglionares (B). Barra de escala = 50 mM.
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Discussão
Targeted injecção da retina e em eletroporação in ovo em retina embrionária no estádio de E4 podem objetivar especificamente as células progenitoras da retina, resultando em a habilidade de visualizar todos os seis principais tipos de células da retina no nível da célula única. Em electroporação in ovo em HH10 (~ E1.5) alvejando o vesícula óptica é capaz de transfectar células que se desenvolvem para formar o olho. No entanto, estas células têm um volume de negócios muito elevado nest...
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Divulgações
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Instalações da Universidade Rutgers.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao Sr. Maaz Enver para o uso de sua câmera HD (Cannon VIXIA HFS100). Este trabalho foi apoiado em parte por concessões do NIH (EY018738), Nova Jersey, Comissão de Pesquisa da Medula Espinhal (08-3074-SCR-E-0 e 10-3091-SCR-E-0), e Prêmio de Pesquisa Biomédica Busch.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| Fertilizados livres de patógenos (SPF) de frango ovos brancos leghorn | Fazendas Sunrise (Catskill, Nova Iorque) | ||
| Chicken ovo incubadora | GQF fabricação, Savannah, GA | Modelo-1550 | Definir a 60% de umidade e 37,5 ° C. |
| Os tubos de vidro capilares | Precision Mundial Instrument Inc. | TW150F-4 | |
| 0,1 ml seringa | Hamilton Co. Reno, Nevada | Estanques 1710 | Seringa Alternativamente 1ml pode ser usado como bem |
| Masterflex Silicone (peróxido) Tubulação | Cole-Parmer | HV-96.400-13 | Corte um pedaço pequeno (1 cm) para anexar a agulha de vidro para a seringa |
| Pinça | Dumont | AA | |
| Micromanipulador | Precision Mundial Instrument Inc. | M3301-M3 | |
| O DNA de plasmídeo | pCAG-GFP foi emprestado do Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Diluir-lo para 0,025% com PBS |
| Gerador de pulso | Harvard Apparatus, MA | BTX ECM 830 | Gerador de onda quadrada |
| Eletrodos | Harvard Apparatus, MA | BTX modelo 514 | Nossos eletrodos foram espaçadas 3-5 mm além |
| Câmera Digital Monocromático | Zeiss, Alemanha | Axiocam MRM | |
| Microscópio de dissecção fluorescente | Leica Microsystems, Alemanha | Leica MZ16FA | |
| Microscópio de fluorescência Upright | Zeiss, Alemanha | Zeiss Axio Imager A1 |
Referências
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
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Reimpressões e permissões
