O objetivo geral deste vídeo é mostrar como executar alvo injeção de retina e In ovo Electroporação de ADN / ARN construtos dentro da retina de pinto embrionário no Hamburger e do estágio Hamilton 22-23, o que é de cerca de dia embrionário 4 (E4). Esta técnica é muito útil para estudar a expressão do gene, regulação do gene, e mudança morfológica no desenvolvimento de retina do pintinho.
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Artigo de método
Em Eletroporação Ovo na retina de pinto embrionário
Neste artigo
Resumo
Resumo
Retina embrionária de galinha é uma excelente ferramenta para estudar o desenvolvimento da retina em vertebrados mais elevados. Por causa de grande tamanho e desenvolvimento externo, ele é comparativamente muito fácil de manipular a retina de pinto embrionário usando recombinante DNA / tecnologia de RNA. Electroporação de ADN / ARN construtos para a retina embrionária têm uma grande vantagem para estudar regulação do gene em retinianas-tronco / progenitoras células durante o desenvolvimento da retina. Tipo diferente de ensaios, tais como ensaio de repórter gene, gene over-expressão, gene knock down (shRNA), etc pode ser realizada utilizando a técnica de electroporação. Este vídeo demonstra alvejado injecção da retina e em eletroporação in ovo dentro da retina de pinto embrionário no Hamburger e do estágio Hamilton 22-23, o que é de cerca de dia embrionário 4 (E4). Aqui nós mostramos uma rápida e conveniente em técnica de eletroporação in ovo através do qual um DNA de plasmídeo que expressa a proteína fluorescente verde (GFP) como um marcador está diretamente entregue napinto espaço sub-retiniano embrionário e seguido por pulsos elétricos para facilitar a absorção de DNA por retina estaminais / progenitoras das células. O novo método de injecção de retina e electroporação em E4 permite a visualização de todos os tipos celulares da retina, incluindo a neurônios tardia-nascido 1, que tem sido difícil com o método convencional da injecção e electroporação em E1.5 2.
Protocolo
Uma vez que algumas partes do protocolo são realizados conforme descrito anteriormente em outros vídeos Jové 2 e papéis 3 com modificações menores não vamos discutir aqueles em detalhe aqui.
1. Manuseio de ovo e Preparação Agulha
- Os ovos podem ser armazenados em um refrigerador de vinho menos cerca de 13 ° C por até 1 semana. Se a temperatura é demasiado elevada, os embriões vai começar a desenvolver de forma anormal, enquanto que, baixa temperatura provoca uma mortalidade de alta. Quando estiver pronto para incubar tirar os ovos do refrigerador de vinho e definir os ovos na vertical com a extremidade maio....
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Discussão
Targeted injecção da retina e em eletroporação in ovo em retina embrionária no estádio de E4 podem objetivar especificamente as células progenitoras da retina, resultando em a habilidade de visualizar todos os seis principais tipos de células da retina no nível da célula única. Em electroporação in ovo em HH10 (~ E1.5) alvejando o vesícula óptica é capaz de transfectar células que se desenvolvem para formar o olho. No entanto, estas células têm um volume de negócios muito elevado nest.......
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Divulgações
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Instalações da Universidade Rutgers.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao Sr. Maaz Enver para o uso de sua câmera HD (Cannon VIXIA HFS100). Este trabalho foi apoiado em parte por concessões do NIH (EY018738), Nova Jersey, Comissão de Pesquisa da Medula Espinhal (08-3074-SCR-E-0 e 10-3091-SCR-E-0), e Prêmio de Pesquisa Biomédica Busch.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| Fertilizados livres de patógenos (SPF) de frango ovos brancos leghorn | Fazendas Sunrise (Catskill, Nova Iorque) | ||
| Chicken ovo incubadora | GQF fabricação, Savannah, GA | Modelo-1550 | Definir a 60% de umidade e 37,5 ° C. |
| Os tubos de vidro capilares | Precision Mundial Instrument Inc. | TW150F-4 | |
| 0,1 ml seringa | Hamilton Co. Reno, Nevada | Estanques 1710 | Seringa Alternativamente 1ml pode ser usado como bem |
| Masterflex Silicone (peróxido) Tubulação | Cole-Parmer | HV-96.400-13 | Corte um pedaço pequeno (1 cm) para anexar a agulha de vidro para a seringa |
| Pinça | Dumont | AA | |
| Micromanipulador | Precision Mundial Instrument Inc. | M3301-M3 | |
| O DNA de plasmídeo | pCAG-GFP foi emprestado do Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Diluir-lo para 0,025% com PBS |
| Gerador de pulso | Harvard Apparatus, MA | BTX ECM 830 | Gerador de onda quadrada |
| Eletrodos | Harvard Apparatus, MA | BTX modelo 514 | Nossos eletrodos foram espaçadas 3-5 mm além |
| Câmera Digital Monocromático | Zeiss, Alemanha | Axiocam MRM | |
| Microscópio de dissecção fluorescente | Leica Microsystems, Alemanha | Leica MZ16FA | |
| Microscópio de fluorescência Upright | Zeiss, Alemanha | Zeiss Axio Imager A1 |
Referências
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Emb....
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Reimpressões e permissões
