Demonstramos FRET entre polydiacetylene polímero conjugado (PDA) e fluoróforo ligado à superfície dos lipossomas de PDA para a detecção de biomoléculas. PDA lipossomas também continha moléculas receptoras nas suas superfícies de biomoléculas a ser utilizados como sondas. Interacções ligando-receptor conduzir a alterações na eficiência de TERF entre o fluoróforo e o PDA, que é a base de mecanismo de detecção.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Monitoramento em tempo real de Ligante-receptor Interações com transferência de energia de ressonância de fluorescência
Neste artigo
Resumo
Resumo
FRET é um processo pelo qual a energia é não-radiativamente transferido de uma molécula dadora para uma molécula animado aceitador estado fundamental por meio de longo alcance interacções dipolo-dipolo 1. No presente ensaio de detecção, utiliza-se uma propriedade interessante de PDA: deslocamento de azul no espectro de absorção de UV-Vis de PDA electrónica (Figura 1) depois de um analito interage com os receptores ligados a PDA 2,3,4,7. Esta mudança no espectro de absorção no PDA proporciona mudanças nas sobreposição espectral (J) entre os PDA (aceitador) e rodamina (dador) que levam a alterações na eficiência de TERF. Assim, as interacções entre a substância a analisar (ligante) e os receptores são detectados através de FRET entre fluoróforos doadores e PDA. Em particular, mostramos a detecção de uma molécula de estreptavidina modelo de proteína. Nós também demonstram a ligação covalente-albumina de soro bovino (BSA) a superfície do lipossoma com FRET mecanismo. Essas interações entre tele lipossomas de bicamada e moléculas de proteína pode ser detectado em tempo real. O método proposto é um método geral para detecção química pequenas e grandes moléculas bioquímicas. Uma vez que a fluorescência é intrinsecamente mais sensível do que a colorimetria, o limite de detecção do ensaio pode ser na gama sub-nanomolar ou inferior 8. Além disso, o PDA pode actuar como um aceitador FRET universal, o que significa que vários sensores podem ser desenvolvidos com PDA (aceitador) funcionalizado com doadores e receptores diferentes ligados à superfície dos lipossomas de PDA.
Protocolo
A. Síntese e Caracterização de Lipossomas de PDA 4,5,6
Nota 1: Proteger a solução da luz PDA usando embalagem de alumínio em cada recipiente ao longo de todas as etapas experimentais.
Nota 2: Dois conjuntos diferentes de solução de lipossoma (B e C) foram preparadas seguinte procedimento A (Síntese e caracterização de lipossomas de PDA).
1. Síntese de N-hidroxi-succinimida Diacteylene (NHS-PCDA)
- Para preparar os lipossomas, um ingrediente essencial PCDA-NHS é necessária. Temos sintetizado PCDA-NHS usando seguinte procedimento:
- Adicionar ácido 10,12-pent....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Realizamos a ligação selectiva do resíduo de lisina da proteína na superfície dos lipossomas utilizando NHS-amina reacção. Este método baseado em FRET é capaz de fazer o acompanhamento em tempo real de ligação biotina-estreptavidina e proteína (BSA), a ligação à superfície do lipossoma. Procedimento semelhante pode ser aplicado para estudar a dinâmica das interacções de ligação proteína diferentes com os seus receptores selectivos. Há flexibilidade na escolha de fluoróforos que irá proporcionar mudanças nos valores de <.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Apoio financeiro para este trabalho foi fornecido através da National Science Foundation, Instituto Nacional de Saúde (NIH), Tecnologia de Materiais Center (MTC) e ORDA em SIUC. Agradecemos a NSF para uma subvenção (CHE-0959568) para a compra de um FE-SEM. Gostaríamos de agradecer ao Prof Mateus McCarroll para discussões úteis. Julia Reyes vai agradecer a COLCIENCIAS, Agência colombiano e Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colômbia por sua bolsa de estudos e apoio financeiro.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| 10,12-pentacosadiynoic ácido (PCDA) | GFS produtos químicos | 3261 | Sensível à luz |
| N-hidroxi-succinimida (NHS) | Acros Organics | 157270250 | Sensíveis à umidade |
| 1 - (3 - (dimetilamino) propil)-3-etilcarbodiimida (EDC) | Chem-impex Internacional | 00050 | |
| 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | |
| Rodamina-tagged Ser Bovinehum Albumina (BSA-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil) (biotina-DOPE) | Avanti Polar Lipids | 870282 |
Referências
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. (1999).
- Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly. Science. 261, 585-....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
