Microscopia multifotônica do cérebro do rato Cleared Expressando YFP

Resumo

Microscopia Multiphoton de órgãos inteiros de rato é possível através opticamente limpando o órgão antes de imagem, mas nem todos os protocolos de preservar o sinal de fluorescência de proteínas fluorescentes. Usando um método de compensação óptica com base de etanol a desidratação e álcool benzílico: benzil benzoato de compensação, que mostram imagens de alta resolução multifotônica de cérebro de rato inteiro expressando YFP.

Resumo

Microscopia Multiphoton de geração de fluorescência intrínseca e segunda harmónica (SHG) de órgãos inteiros de rato é possível graças opticamente limpeza do órgão, antes de imagem. ^1,2 No entanto, para os órgãos que contêm proteínas fluorescentes, tais como GFP e YFP, protocolos de compensação ópticos que usam metanol desidratação e clara usando álcool benzílico: benzoato de benzila (BABB) enquanto desprotegido de ³ luz não preservam o sinal fluorescente. O protocolo aqui apresentado é uma nova forma em que para realizar compensação órgão inteiro óptico no cérebro do rato, preservando o sinal de fluorescência de YFP expressa em neurónios. A modificação do protocolo de compensação óptica de tal modo que o órgão é desidratado usando uma série graduada de etanol foi encontrada para reduzir os danos para as proteínas fluorescentes e preservar o seu sinal fluorescente para imagiologia multifotônica. ⁴ Utilizando um método optimizado de compensação óptica com base de etanol e de desidratação desmatamento por BABBenquanto protegida da luz, que mostram imagens de alta resolução multifotônica de proteína fluorescente amarela expressão (YFP), nos neurónios do cérebro de um rato mais de 2 mm abaixo da superfície do tecido.

Protocolo

1. Perfusão Animal ⁵ e Compensação cérebro inteiro Rato

1. O comprimento total do procedimento podem variar, dependendo do período de tempo utilizado por passo de desidratação, no total, mas de todo o processo pode ser conduzido em dois dias.
2. Pesar ratos YFP e em seguida profundamente anestesiar com uma injecção intraperitoneal de cetamina / xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg).
3. Confirmar um plano cirúrgico de anestesia profunda antes de prosseguir para a cirurgia. Verifique o animal a cada 5 minutos para ver se ele reage a um dedo do pé firme ou pitada cauda. Se o animal reage, uma dose suplementar (1/3 da dose original) de cetam....

Discussão

Enquanto padrão corantes orgânicos são compatíveis com uma variedade de solventes orgânicos, e, portanto, não representam um desafio especial para limpar os protocolos, as proteínas fluorescentes são menos tolerantes a mudanças em solvente. ⁴ O objetivo do presente trabalho foi o de superar uma séria limitação ópticos anteriores protocolos de compensação onde fluorescência de XFPs foi perdida ou seriamente prejudicado. As imagens que são aqui apresentados demonstram que a fluorescência de YFP foi preservada. .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Solução salina tamponada com fosfato	Sigma-Aldrich, Inc.	D8537	500 ml, pH 7,2
Paraformaldeído	Electron Microscopy Sciences	15710	10 x 10 ml de paraformaldeído, 16%
Álcool etílico	Americana Bioanalytical	AB00515-00500	500 ml, 200 proof
Álcool etílico	Pharmco Products, Inc.	111000190	1 gal., 190 provas
O álcool benzílico	Sigma-Aldrich, Inc.	402834	500 ml, 99% +
Benzoato de benzilo	Sigma-Aldrich, Inc.	B6630-IL	500 ml, 99% ≥
5X/0.5 objetivo NA	Nikon	AZ Farinha Plano de 5X	15 WD