Detecção MicroRNA em tumores de próstata por Quantitative PCR em tempo real (qPCR)

Resumo

Quantitativa em Tempo Real reacção em cadeia da polimerase (qPCR) é um método rápido e sensível para investigar os níveis de expressão de vários microRNA (miRNA) moléculas em amostras de tumor. Usando este método de expressão de centenas de moléculas miRNA diferentes pode ser amplificado, quantificado e analisado a partir do mesmo modelo cDNA.

Resumo

MicroRNAs (miRNAs) são de cadeia simples, 18-24 nucleótidos de comprimento, moléculas de RNA não codificantes. Eles estão envolvidos em praticamente todos os processos celulares, incluindo o desenvolvimento ^{1, 2} apoptose e regulação do ciclo celular ^3. MiRNAs Estima-se que regulam a expressão de 30% a 90% de genes humanos ⁴ por ligação aos seus RNAs alvo mensageiro (ARNm) ^5. Desregulação generalizada de miRNAs tem sido relatada em várias doenças cancerosas e subtipos ^6. Devido à sua prevalência e estrutura única, estas moléculas pequenas são susceptíveis de ser a próxima geração de biomarcadores, agentes terapêuticos e / ou alvos.

Os métodos utilizados para investigar a expressão de miRNA incluem SYBR green eu à base de corantes, bem como Taqman-sonda qPCR base. Se miRNAs estão a ser efetivamente utilizado na prática clínica, é imperativo que a sua detecção, frescos e / ou arquivados amostras clínicas ser preciso, reprodutível e specific. qPCR tem sido amplamente utilizado para validar a expressão de miRNAs em análises do genoma inteiro, tais como estudos microarray ^7. As amostras utilizadas neste protocolo eram de pacientes que foram submetidos a prostatectomia radical para o cancro da próstata clinicamente localizado, no entanto outros tecidos e linhas celulares pode ser substituído pol espécimes de próstata foram snap-congelado em azoto líquido após a ressecção. As variáveis ​​clínicas e follow-up de informação para cada paciente foram coletadas para análise posterior ^8.

Quantificação dos níveis de miRNA em amostras de tumores de próstata. As etapas principais da análise qPCR de tumores são: a extracção de RNA total a síntese de cDNA, e detecção de produtos de qPCR usando miRNA primers específicos. O RNA total, que inclui mRNA, miRNA, e outros pequenos RNAs foram extraídos a partir de amostras utilizando reagente Trizol. Sistema da QIAGEN miScript foi utilizado para sintetizar ADNc e realizar qPCR (Figura 1). MiRNAs endógenos não são polyadenylated, portanto, durante o processo de transcrição reversa, uma polimerase de (A) poli polyadenylates o miRNA. O miRNA é utilizado como um modelo para sintetizar ADNc utilizando oligo-dT e transcriptase reversa. Uma sequência de etiqueta universal sobre a extremidade 5 'de oligo-dT iniciadores facilita a amplificação de cDNA no passo de PCR. A amplificação por PCR do produto é detectado pelo nível de fluorescência emitida pelo SYBR Green, um corante que intercala em DNA de cadeia dupla. Primers específicos miRNA, juntamente com um Primer Universal que se liga à seqüência tag universal irá amplificar sequências específicas de miRNA.

Os ensaios Primer miScript estão disponíveis para mais de mil humano miRNAs específicos e centenas de murino específicos miRNAs. Método de quantificação relativa foi usado aqui para quantificar a expressão de miRNAs. Para corrigir para a variabilidade entre diferentes amostras, níveis de expressão de um miRNA alvo é normalizado para os níveis de expressão de um gene de referência. A escolha de um geem que ne para normalizar a expressão de alvos é crítica na método de quantificação relativa de análise. Exemplos de genes de referência tipicamente usados ​​nesta capacidade são o RNU6B pequenos RNAs, RNU44, e RNU48 como eles são considerados ser estavelmente expressos na maior parte dos exemplos. Neste protocolo, RNU6B é usado como o gene de referência.

Protocolo

1. Coleta de Amostras de próstata

1. Recolher as amostras da próstata, no momento da prostatectomia. A amostra é orientada usando marcos anatômicos. A próstata e as vesículas seminais são pintadas como segue: verde do lado direito, azul lado esquerdo.
2. Um midsection aleatória transversal da próstata é tomada perpendicularmente à superfície rectal, congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C ^9.
3. Bancados fatias de espécimes são fotocopiadas, orientado (anterior, posterior, direita e esquerda), quadrisected. As secções são cortadas utilizando o criostato.
4. As seções são corados com H & E e revisadas por um pato....

Discussão

Expressões aberrantes de alguns miRNAs foram consistentemente encontrados em tumores de próstata quando comparado com o tecido normal ^10, e alguns destes miRNAs foram nomeados como potenciais novos agentes terapêuticos contra o cancro da próstata ^11. Assim, os níveis de expressão aberrante de miRNAs podem ser úteis biomarcadores de diagnóstico e / ou prognóstico. A metodologia qPCR Real-Time aqui apresentado proporciona um ensaio para a quantificação precisa dos níveis de miRNA em tecidos tumorais .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do o reagente de	Companhia	Número de catálogo
Reagente de TRIzol	Invitrogen	15596
miScript Kit de Transcrição em reverssa	Qiagen	218061
miScript Assays Primer	Qiagen	Experiment específico
miScript SYBR Green PCR Kit	Qiagen	218073
LightCycler 3,5 Real-Time Sistema de PCR	Roche
Luz Cycler Capilares	Roche	04929292001
NanoDrop 1000 espectrofotômetro	Thermo Scientific	2538
Agilent 2100 Bioanalyzer	G2943CA