Descrevemos os protocolos para a colheita murinos macrófagos alveolares, que são residentes as células imunes inatas no pulmão, e examinando a sua ativação em resposta a co-cultura com nanopartículas polianidrido.
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Artigo de método
Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nanopartículas biodegradáveis surgiram como uma plataforma versátil para a concepção e implementação de novas vacinas intranasais contra doenças respiratórias infecciosas. Especificamente, polianidrido nanopartículas composto do ácido alifático sebácico (SA), a aromático 1,6-bis (p-carboxifenoxi)-hexano (CPH), ou o anfifílico 1,8-bis (p-carboxifenoxi) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) exibem grandes quantidades única e cinética de erosão de superfície 1,2 e pode ser explorado para libertar lentamente biomoléculas funcionais (por exemplo, os antigénios de proteínas, imunoglobulinas, etc) in vivo 3,4,5. Estas nanopartículas também possuem atividade adjuvante intrínseco, tornando-os uma excelente escolha para uma plataforma de entrega de vacina 6,7,8.
A fim de elucidar os mecanismos que regulam a ativação da imunidade inata após a vacinação da mucosa nasal, deve-se avaliar as respostas moleculares e celulares da p antígenocélulas ressentindo (APCs) responsáveis pelo início respostas imunes. As células dendríticas são as principais APCs encontradas na condução das vias aéreas, enquanto os macrófagos alveolares (AMɸ) predominam no parênquima pulmonar 9,10,11. AMɸ são altamente eficientes na limpeza dos pulmões de micróbios patogénicos e restos celulares 12,13. Além disso, este tipo de célula desempenha um papel importante no transporte de antigénios microbianos para os nódulos linfáticos de drenagem, que é um primeiro passo importante na iniciação de uma resposta imunitária adaptativa 9. AMɸ também expressam níveis elevados de reconhecimento de padrões inata e receptores de catadores, pró-inflamatórias secretam mediadores, e principais células T naive 12,14. Uma população relativamente pura de AMɸ (por exemplo, superior a 80%) pode ser facilmente obtida por meio de lavagens pulmonares para o estudo em laboratório. Residente AMɸ colhidas a partir de animais imunes competentes proporcionar um fenótipo representante dos macrófagos que irá encounter vacina da partícula baseada em in vivo. Descrevemos os protocolos utilizados para colheita e cultura AMɸ de camundongos e examinar o fenótipo de ativação dos macrófagos após o tratamento com nanopartículas polianidrido in vitro.
Protocolo
1. Colheita macrófagos alveolares (AMɸ) do mouse usando lavagem pulmonar
- Use equipamento de proteção individual (EPI), tais como jaleco, luvas descartáveis, e proteção ocular adequada.
- Prepare completa AMɸ (cAMɸ) médio antes do início da colheita. Adicionar 2,5 mL de penicilina / estreptomicina (pen / strep) solução, 250 uL de β-mercaptoetanol (2-mercaptoetanol), e 25 mL de calor de soro fetal inactivado bovino (FBS) a 222,25 ml de Modificado Dulbelcco de Eagle Médium (DMEM). Filtro-esterilizar cAMɸ média usando um 0,2 uM de poro de tamanho filtro superior garrafa sob vácuo.
- Euthanize um rato saudável por asfixia CO 2 em uma ....
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Discussão
Plataformas polianidrido vacina nanopartículas demonstraram eficácia quando administrada por via intranasal em regimes de dose única 5. Medindo a activação das populações de células fagocíticas residentes nos pulmões induzidos por esta plataforma de entrega de vacina permite a avaliação da sua capacidade potencial para, em última análise promover respostas imunes adaptativas.
Especificamente, a colheita macrófagos alveolares no lavado pulmonar e tratá-los com diferentes formulaçõe.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer os EUA Army Medical Research e Material Command (Números Grant W81XWH-09-1-0386 e W81XWH-10-1-0806) para apoio financeiro e Shawn Dr. Rigby pela Universidade do Estado Iowa Facilidade de Citometria de Fluxo para sua assistência técnica especializada.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de Catálogo | Comentários |
| CAM Mídia | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercaptoetanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Penicilina / estreptomicina 10.000 mg / ml Solução | Cellgro | 30-002-CI | |
| Soro Fetal Bovino | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Tampão FACS | |||
| Cloreto de sódio | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Fosfato de sódio | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Cloreto de potássio | Fisher Scientific | P217500 | |
| Fosfato de potássio | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (albumina de soro bovino) | Sigma | A7888 | |
| Azida de sódio | Sigma | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC haplótipo II IA / IE, clone M5/114.15.2, conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) | EBIOScience | 11-5321 | |
| CD86 anti-rato, o clone GL-1, conjugado com aloficocianina (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| CD40 anti-rato, o clone 1C10, conjugada com a APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-rato CD209, clone 5H10, conjugado com biotina | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-rato CD11b, clone M1/70, conjugado com Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-ratinho F4/80, clone BM8, conjugado com ficoeritrina (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-estreptavidina Texas vermelho conjugado | BD Biosciences | 551487 | |
| Outros Fornecimentos e Reagentes | |||
| Etanol | Fisher Scientific | A405-20 | Usado como 70% (v / v) |
| Comprimido CO 2 | Linweld | 16000060 | |
| Seringa de 1 mL | BD Biosciences | 309659 | |
| Soberano 3 ½ "Pe. Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Gabinete de Biossegurança | NUAIRE | Série 22 | |
| Tesouras de dissecação | Pescador | 138082 | |
| Fórceps | Roboz | RS-8254 | |
| PBS, 1X sem cálcio e magnésio | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 ml Tubos da centrífuga com tampa de rosca | VWR International | 21008-216 | |
| Seis bem Cultura tecido tratado Placas | Costar | 3516 | |
| Tubo de plástico Racks | Nalgene | 5970 | |
| Célula Scraper 24 centímetros | TPP | 99002 | |
| 5 mL de poliestireno Tubo de fundo redondo | Falcão | 352008 | |
| Pipetar ajuda-XL | Drummond | 4-000-105 | |
| 10, 5, e 2 mL Pipetas | Pescador | 13-675 | |
| 200 e 10 uL micropipetas | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 e 10 L ponteiras | Pescador | 02-707 | |
| BD de estabilizaçãoFixador | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluente | Beckman-Coulter | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Reagente Lítico | Beckman-Coulter | 7546138 | |
| Coulter Counter frascos de poliestireno | Beckman-Coulter | 14310-684 | |
| Tubos de ensaio | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipamento | |||
| Centrífuga refrigerada | Labnet | 50075040 | |
| Incubadora de CO 2 umidificado | Nuaire | Modelo Autoflow 8500 | |
| FACSCanto citómetro de fluxo | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter do contador de partículas Z1 | Beckman-Coulter | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicador equipamento de processamento de líquido com MicroTip | Misonix | Modelo No. S-4000 |
Referências
- Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Immunomodulatory biomaterials. Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. ....
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Reimpressões e permissões
