Descrevemos os protocolos para a colheita murinos macrófagos alveolares, que são residentes as células imunes inatas no pulmão, e examinando a sua ativação em resposta a co-cultura com nanopartículas polianidrido.
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Artigo de método
Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nanopartículas biodegradáveis surgiram como uma plataforma versátil para a concepção e implementação de novas vacinas intranasais contra doenças respiratórias infecciosas. Especificamente, polianidrido nanopartículas composto do ácido alifático sebácico (SA), a aromático 1,6-bis (p-carboxifenoxi)-hexano (CPH), ou o anfifílico 1,8-bis (p-carboxifenoxi) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) exibem grandes quantidades única e cinética de erosão de superfície 1,2 e pode ser explorado para libertar lentamente biomoléculas funcionais (por exemplo, os antigénios de proteínas, imunoglobulinas, etc) in vivo 3,4,5. Estas nanopartículas também possuem atividade adjuvante intrínseco, tornando-os uma excelente escolha para uma plataforma de entrega de vacina 6,7,8.
A fim de elucidar os mecanismos que regulam a ativação da imunidade inata após a vacinação da mucosa nasal, deve-se avaliar as respostas moleculares e celulares da p antígenocélulas ressentindo (APCs) responsáveis pelo início respostas imunes. As células dendríticas são as principais APCs encontradas na condução das vias aéreas, enquanto os macrófagos alveolares (AMɸ) predominam no parênquima pulmonar 9,10,11. AMɸ são altamente eficientes na limpeza dos pulmões de micróbios patogénicos e restos celulares 12,13. Além disso, este tipo de célula desempenha um papel importante no transporte de antigénios microbianos para os nódulos linfáticos de drenagem, que é um primeiro passo importante na iniciação de uma resposta imunitária adaptativa 9. AMɸ também expressam níveis elevados de reconhecimento de padrões inata e receptores de catadores, pró-inflamatórias secretam mediadores, e principais células T naive 12,14. Uma população relativamente pura de AMɸ (por exemplo, superior a 80%) pode ser facilmente obtida por meio de lavagens pulmonares para o estudo em laboratório. Residente AMɸ colhidas a partir de animais imunes competentes proporcionar um fenótipo representante dos macrófagos que irá encounter vacina da partícula baseada em in vivo. Descrevemos os protocolos utilizados para colheita e cultura AMɸ de camundongos e examinar o fenótipo de ativação dos macrófagos após o tratamento com nanopartículas polianidrido in vitro.
Protocolo
1. Colheita macrófagos alveolares (AMɸ) do mouse usando lavagem pulmonar
- Use equipamento de proteção individual (EPI), tais como jaleco, luvas descartáveis, e proteção ocular adequada.
- Prepare completa AMɸ (cAMɸ) médio antes do início da colheita. Adicionar 2,5 mL de penicilina / estreptomicina (pen / strep) solução, 250 uL de β-mercaptoetanol (2-mercaptoetanol), e 25 mL de calor de soro fetal inactivado bovino (FBS) a 222,25 ml de Modificado Dulbelcco de Eagle Médium (DMEM). Filtro-esterilizar cAMɸ média usando um 0,2 uM de poro de tamanho filtro superior garrafa sob vácuo.
- Euthanize um rato saudável por asfixia CO 2 em uma câmara de eutanásia. Embora um rato C57BL / 6 (6-8 semanas de idade) foi utilizado para os fins do presente projecto, esta técnica de lavagem pulmonar pode ser realizada em qualquer estirpe de rato. Usando um cilindro de gás comprimido, deixe o fluxo de gás para a câmara de 1 min antes de colocar o mouse na châmbar para assegurar que a câmara está totalmente carregada com CO 2. Colocar o rato na câmara por pelo menos um minuto a eutanásia no rato. Além disso, desangrar cada rato através de punção cardíaca como um método físico para confirmar a morte do rato como descrito em 1.4.
- Lay rato na sua parte traseira (lado dorsal), spray com etanol a 70%, localizar o esterno e, a um ângulo de 30 graus a partir do abdómen, inserir uma agulha de calibre 23 (ligada a uma seringa de 1 mL) cerca de 50 mm para dentro da cavidade torácica . Com a colocação adequada da agulha, que deveria ser possível recolher entre 0,4 a 1 mL de sangue, dependendo do tamanho do rato. Examine o animal para a cessação dos sinais vitais.
- Lugar do mouse sobre bancada do laboratório para que ele esteja mentindo sobre o seu abdome (lado ventral). Pulverização do rato com etanol a 70% para esterilizar o ambiente de trabalho. Belisque a pele da metade para baixo da coluna do mouse. Com uma tesoura de dissecção que foram esterilizadas com etanol 70%, fazer uma pequena incisão através da pele.
- Agarrar a pele em ambos os lados da incisão e puxar a pele em direcções opostas ao longo do eixo crânio-caudal do rato. Quando feito correctamente, a pele irá ser removido da carcaça subjacente.
- O pescoço do mouse deve agora mostrar músculos expostos e glândulas. Corte com cuidado o tecido e puxe-o para o anterior do mouse com a pinça, expondo assim a laringe, traquéia, esôfago e do mouse. Evitar o corte da veia jugular ou da artéria carótida.
- A traqueia é agora visível e é identificável como o tecido com anéis cartilaginosos em torno dele. Delicadamente segurar a traqueia com uma pinça e suavemente levantar e separar a traqueia a partir do esófago, que está localizado no lado dorsal.
- Fazer uma pequena incisão anterior para onde um detém a traqueia, mas posterior para a laringe. A incisão deve ser feita a cerca de ângulo de 45 °. Além disso, não completamente transect a traquéia, pois isso irá impedi-lo de retracção ema cavidade do corpo.
- Encher uma seringa cc 1 equipado com um cateter de gato Tom com PBS estéril, em preparação para inserir o cateter para dentro do lúmen da traqueia. Segure a traquéia usando uma pinça e com a mão segure o cateter perto da ponta para aumentar o controle e gentilmente insira-o no local da incisão traqueal. Insira cuidadosamente cateter na traquéia cerca de 20 mm. Agarrar a traqueia que é em torno do tubo de cateter, libertando a outra mão.
- Utilizando uma seringa de 1 ml, equipado com o cateter, suavemente infundir 0,75 mL de temperatura ambiente, PBS estéril para dentro dos pulmões e, em seguida, aspirar cuidadosamente a parte de trás PBS para a seringa. Repita este processo três vezes, enquanto externamente massageando o peito. Desligue a seringa do cateter e dispensar o fluido de lavagem para um tubo de centrífuga de 15 mL. Após o enchimento da seringa com 0,75 mL de PBS fresco e voltar a ligar a seringa ao cateter, repetir os passos 1,9 e 1,10 duas vezes para cada rato. Recuperação de fluido pode ser parcial, a obtenção de menos do que o volume infundido. Se recolher células a partir de mais de um rato, colocar o tubo 15 mL com as células colhidas em gelo até que todas as lavagens de pulmão foram realizados.
2. Processamento de Colheita lavagem pulmonar AMɸ
- Centrifugar fluido lavagem pulmonar a 250 X g durante 10 min a 4 ° C.
- Utilizando uma técnica asséptica, decante o sobrenadante em recipiente adequado de lixo dentro de uma cabine de segurança biológica. Ressuspender o sedimento de células por suavemente raking do tubo de centrifugação através da parte superior de um suporte de tubos de ensaio. Adicionar 1 mL de meio de cAMɸ para ressuspender as células.
- Enumerar as células utilizando um contador de partículas Coulter Z1 por pipetagem de 20 uL de células em 10 mL de Isoton II diluente em Coulter frasco contador. Adicionar 3 a 4 gotas de Zap-oglobin reagente II lítica em frasco, inverter cuidadosamente 3 a 4 vezes e, em seguida, carregar o frasco de amostra para o contador para se obter uma concentração de células. Certifique-se de programar o contador com um fator de diluição de 2 x 10 4 para exibir aconcentração de células como o número de células por mL.
- Diluir as células a 2,5 x 10 5 por mL utilizando meio cAMɸ.
- Pipetar 2 mL de 2,5 x 10 5 células / ml em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços.
- Para enriquecer para AMɸ, pratos de cultura dentro de uma incubar a 37 ° C incubadora humidificada com uma atmosfera de 5% de CO2 durante 6 h para permitir que as células aderem ao fundo do poço. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante a não perturbar as células aderentes.
- Lavar os poços utilizando PBS estéril (cálcio e magnésio livre) para remover as células não aderentes e detritos. Adicionar 2 mL de meio de cAMɸ a cada poço.
- Incubar as células durante a noite no interior de um 37 ° C incubadora humidificada com uma atmosfera de 5% de CO 2 antes da adição de estimulantes. Após este passo de enriquecimento, aproximadamente 87% das células são positivas para o macrófago marcadores CD11b e F4/80 (Figura 2c).
3. A adição de PolyanhydridNanopartículas de e os tratamentos
- Fabricar nanopartículas através nanoencapsulação polianidrido anti-solvente 15. Neste processo, o polímero é dissolvido em cloreto de metileno (4 ° C a uma concentração de 25 mg / mL) e precipitado em pentano (-20 ° C a uma razão de 1:200 cloreto de metileno: pentano).
- Pesar nanopartículas polianidrido usando esterilizado pesar papel em um equilíbrio que pode medir com precisão quantidades microgramas. Adicionar partículas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Volte a suspender as nanopartículas no gelo frio cAMɸ. Os cálculos são feitos de tal forma que não mais do que 0,3 mL de meio é adicionado a cada poço para obter a concentração desejada de nanopartículas. Manter as partículas resuspensas em gelo até que as nanopartículas são adicionadas ao poço de cultura.
- Antes de adicionar as nanopartículas para as culturas AMɸ, sonicar partículas usando um sonicador de bancada com uma microponta. Esterilizar microtip por pulverização com etanol a 70% e wiping com um Kimwipe estéril antes da sonicação. Sonicar a 10-20 joules por 30 a 45 s, mantendo o tubo em gelo. Observe suspensão de nanopartículas macroscopicamente. Se as partículas não são suficientemente disperso, permitir que a suspensão para definir em gelo durante 1 a 2 min para assegurar que as nanopartículas são abaixo da temperatura de transição vítrea do polímero antes sonicando novamente por 30 a 45 seg. A finalidade deste passo de sonicação é adequadamente dispersar as nanopartículas, como o CPTEG 50:50: nanopartículas CPH tendem a agregar quando expostos a um ambiente aquoso. No entanto, alguns pequenos agregados de nanopartículas ainda pode permanecer na suspensão.
- Suspensão de nanopartículas (adequadamente dispersa) deve ser mantido em gelo e ser usado imediatamente para evitar prematura erosão de superfície ou de agregação.
- Remova as placas de cultura contendo o AMɸ da incubadora e coloque no gabinete de biossegurança. Tilt placa em aproximadamente um ângulo de 45 graus e pipeta fora a quantidade de mediUM que será adicionada à suspensão de nanopartículas (também não deve exceder 0,3 mL). Não perturbe as células aderentes ao retirar do meio.
- Vórtice a suspensão de nanopartículas polianidrido brevemente antes de a adicionar aos poços apropriados. Pipetar a quantidade de suspensão de nanopartículas (não mais do que 0,3 mL) para dentro do poço específico (s), no entanto, não pipetar cima e para baixo para misturar. Esta ação poderia retirar o aderente AMɸ do poço. As partículas irão assentar no fundo do poço, e contactar as células. Para os estudos descritos neste relatório, a concentração final de nanopartículas co-cultivados com o AMɸ foi de 125 ug / mL. Prossiga com os poços e os grupos subseqüentes tratamento desejado. Incluem grupos de controlo positivo e negativo, como único meio e 200 lipopolissacárido ng / mL (LPS) a poços designados.
- Retornar os pratos de cultura para a 37 ° C humidificada incubadora com atmosfera de 5% de CO2 durante 48 h. Os estudos cinéticos em nossa Laboratory demonstraram 48 horas para ser o período de cultura óptima para a avaliação tanto a expressão do marcador de superfície celular ea secreção de citocinas como o que permite um tempo adequado para a transcrição ea síntese de proteínas a ocorrer. Embora os níveis mais elevados de citocinas acumular-se durante um período de cultura prolongada (isto é, 72 hr), avaliando célula expressão do marcador de superfície, neste ponto do tempo pode ser confundida com a contribuição dos níveis elevados de citocinas. As alterações na expressão do marcador de superfície observada pode não ser directamente atribuível à estimulação com as nanopartículas em si.
4. Avaliando AMɸ Ativação utilizando citometria de fluxo
- Preparar fluorescência-activated separação de células (FACS) tampão (0,1% de azida sódica e 0,1% de albumina de soro bovino (BSA)) em 0,1 M de fosfato salino tamponado (pH 7,4) antes da colheita dos macrófagos banhados que foram co-cultivados com nanopartículas oestimulantes r.
- Prepare soluções de trabalho do tampão de bloqueio e os anticorpos monoclonais. Para preparar o tampão de bloqueio, diluir rato IgG (Sigma) e anti-CD16/32 (eBioscience) a 1 mg / mL e 10 ug / mL, respectivamente, em tampão de FACS. Diluir superfície do painel de anticorpo marcador em tampão FACS, quer o fabricante concentração recomendada ou a concentração do usuário optimizado. Para os resultados apresentados neste trabalho, o painel de marcador de superfície é constituído por anticorpos contra MHC II, CD86, CD40 e CIRE (CD209). Anti-rato de anticorpos contra os marcadores de macrófagos F4/80 e CD11b também estão incluídos no painel para identificar positivamente o fenótipo de macrófagos durante a análise de dados. Cuidados devem ser tomados ao selecionar anticorpos contra moléculas de MHC II, como linhagens puras, muitas vezes diferem em seus haplótipos MHC II. Os anticorpos selecionados devem reagir com os aloantígenos específicos de MHC expressas pelo seu estirpe de ratinhos de interesse.
- Após 48 h de incubação com nanopartículas e / ouestimulantes, os pratos de cultura de células lugar em gelo durante 20 min. Para remover os macrófagos aderentes a partir das placas, raspe poços com um raspador de células de 24 cm.
- Usando uma pipeta de 5 mL serológica, aspirar cuidadosamente as células e meio de cima e para baixo cinco vezes para gerar uma única suspensão celular. Pipetar os conteúdos dos poços individuais em separado 5 tubos de poliestireno mL de modo a não se misturam as células de diferentes tratamentos experimentais.
- Adicionar 2 mL de tampão de FACS a cada tubo.
- Centrifugar os tubos de células a 250 x G a 4 ° C durante 10 min.
- Decantar o sobrenadante e ressuspender suavemente pellet celular em líquido residual por flanqueando os tubos através da parte superior de um suporte de tubos de ensaio.
- A fim de impedir a ligação não específica dos anticorpos monoclonais, adicionam-se 10 uL de tampão de bloqueio (preparado em 4,2) a cada tubo de células. Tubos de vórtice e incubar em gelo durante 30 min.
- Adicionar volume apropriado de diluídos anticorpos monoclonais a cada tubo e incubcomeu no escuro em gelo durante 15 min. Os tubos que contêm amostras a serem analisadas devem receber a combinação de anticorpos do painel polycromatic (optimização anterior de combinação de anticorpos devem ser realizados por laboratórios individuais). Grupos de controlo adicionais devem ser incluídos para configurar correctamente os parâmetros de aquisição no citómetro de fluxo, incluindo um tubo de células que não foram marcadas, e os tubos de compensação que correspondem a células marcadas usando cada cor única separadamente. Para configurar corretamente as portas para a análise por citometria de fluxo, a fluorescência Minus One (FMO) controlos devem ser incluídos durante a aquisição. Controles FMO são células marcadas com todos os anticorpos conjugados com fluorocromo que são utilizados no painel excepto aquele que é substituído pelo seu controlo de isotipo correspondente. Populações positivas e negativas (ie, alíquotas separadas de células tratadas com um estimulante de controlo positivo e apenas meio) deve também ser incluídos na FMO e tubos de controlo de compensação.
- Adicionar 2 mL de tampão de FACS para cada tubo de vórtice, e centrifugar a 250 x G a 4 ° C durante 10 min.
- Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em células de fluido residual por flanqueando os tubos através da parte superior de um suporte de tubos de ensaio.
- Se o painel de anticorpos constituída por um anticorpo não directamente conjugado com um fluorocromo mas é preferivelmente conjugado com biotina, um fluorocromo-estreptavidina é necessário para visualizar o marcador de superfície. Neste passo, adicionar um volume apropriado da estreptavidina fluorocromo-diluído e incubar no escuro durante 15 min em gelo. Como em 4,2, o estreptavidina irá ser diluído para uma concentração recomendada pelo fabricante ou para um optimizado pelo utilizador. Este passo só é necessário para painéis contendo biotiniladas anticorpos primários.
- Executar um passo de lavagem como descrito em 4,10.
- Diluir um volume apropriado de BD estabilização 01:03 fixador em água desionizada. Adicionar 100 uL de fixador diluído a cada tubo, enquanto suavemente vortexing para evitar aglomeração das células. Células marcadas e fixadas podem ser estavelmente armazenadas no escuro a 4 ° C durante aproximadamente uma semana antes da aquisição de um citómetro de fluxo.
5. Os dados representativos
As nanopartículas fabricadas na etapa 3,1 tinha um diâmetro médio de 163 ± 24 nm e uma morfologia consistente com aquele obtido em estudos anteriores 5,16. Nanopartículas em solução antes e após a sonicação são mostrados na Figura 1 para demonstrar a necessidade de sonicação para assegurar a dispersão adequada das partículas. Análise de citometria de fluxo de AMɸs colhidas obtidos através de lavagem pulmonar é mostrado na Figura 2. Marcação das células com uma combinação de anti-rato CD11b e anti-rato F4/80 anticorpos, bem como os controlos correspondentes FMO permite o estabelecimento de rotulagem de fundo, identificando AMɸs e gating para análise posterior. Tratamento de macrófagos alveolares com polianidridonanopartículas aumenta a activação como mostrado pela intensidade média de fluorescência aumentada de MHC II, CD40, CD86, e CIRE (Figura 3).
. Figura 1 50:50 CPTEG: CPH nanopartículas antes de (A) e após (B) s 30 de sonicação.
Figura 2. Análise por citometria de fluxo de colhidas macrófagos alveolares marcadas com (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b ea PE-Cy7 FMO de controlo, (B) Alexa Fluor 700 FMO de Controlo e do anti-F4/80 PE-Cy7 e (C ) Alexa Fluor 700 anti-CD11b e PE-Cy7 anti-F4/80. O número no canto superior direito representa a porcentagem de células positivas duplo.
Figura 3. Histogramas demonstrando um aumento na intensidade de fluorescênciadade para a expressão de superfície de MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) e CIRE (D) após co-cultura de macrófagos alveolares com CPTEG 50:50: polianidrido de CPH nanopartículas durante 48 horas. Os histogramas mostram resultados para AMɸ rotulados como controles (FMO 
), Não tratado AMɸ rotulado com anticorpos contra todos os marcadores de superfície celular ( 
) E AMɸ cultivadas com nanopartículas e marcadas com anticorpos contra todos os marcadores de superfície celular ( 
).
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Discussão
Plataformas polianidrido vacina nanopartículas demonstraram eficácia quando administrada por via intranasal em regimes de dose única 5. Medindo a activação das populações de células fagocíticas residentes nos pulmões induzidos por esta plataforma de entrega de vacina permite a avaliação da sua capacidade potencial para, em última análise promover respostas imunes adaptativas.
Especificamente, a colheita macrófagos alveolares no lavado pulmonar e tratá-los com diferentes formulaçõe...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer os EUA Army Medical Research e Material Command (Números Grant W81XWH-09-1-0386 e W81XWH-10-1-0806) para apoio financeiro e Shawn Dr. Rigby pela Universidade do Estado Iowa Facilidade de Citometria de Fluxo para sua assistência técnica especializada.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de Catálogo | Comentários |
| CAM Mídia | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercaptoetanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Penicilina / estreptomicina 10.000 mg / ml Solução | Cellgro | 30-002-CI | |
| Soro Fetal Bovino | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Tampão FACS | |||
| Cloreto de sódio | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Fosfato de sódio | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Cloreto de potássio | Fisher Scientific | P217500 | |
| Fosfato de potássio | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (albumina de soro bovino) | Sigma | A7888 | |
| Azida de sódio | Sigma | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC haplótipo II IA / IE, clone M5/114.15.2, conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) | EBIOScience | 11-5321 | |
| CD86 anti-rato, o clone GL-1, conjugado com aloficocianina (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| CD40 anti-rato, o clone 1C10, conjugada com a APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-rato CD209, clone 5H10, conjugado com biotina | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-rato CD11b, clone M1/70, conjugado com Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-ratinho F4/80, clone BM8, conjugado com ficoeritrina (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-estreptavidina Texas vermelho conjugado | BD Biosciences | 551487 | |
| Outros Fornecimentos e Reagentes | |||
| Etanol | Fisher Scientific | A405-20 | Usado como 70% (v / v) |
| Comprimido CO 2 | Linweld | 16000060 | |
| Seringa de 1 mL | BD Biosciences | 309659 | |
| Soberano 3 ½ "Pe. Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Gabinete de Biossegurança | NUAIRE | Série 22 | |
| Tesouras de dissecação | Pescador | 138082 | |
| Fórceps | Roboz | RS-8254 | |
| PBS, 1X sem cálcio e magnésio | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 ml Tubos da centrífuga com tampa de rosca | VWR International | 21008-216 | |
| Seis bem Cultura tecido tratado Placas | Costar | 3516 | |
| Tubo de plástico Racks | Nalgene | 5970 | |
| Célula Scraper 24 centímetros | TPP | 99002 | |
| 5 mL de poliestireno Tubo de fundo redondo | Falcão | 352008 | |
| Pipetar ajuda-XL | Drummond | 4-000-105 | |
| 10, 5, e 2 mL Pipetas | Pescador | 13-675 | |
| 200 e 10 uL micropipetas | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 e 10 L ponteiras | Pescador | 02-707 | |
| BD de estabilizaçãoFixador | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluente | Beckman-Coulter | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Reagente Lítico | Beckman-Coulter | 7546138 | |
| Coulter Counter frascos de poliestireno | Beckman-Coulter | 14310-684 | |
| Tubos de ensaio | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipamento | |||
| Centrífuga refrigerada | Labnet | 50075040 | |
| Incubadora de CO 2 umidificado | Nuaire | Modelo Autoflow 8500 | |
| FACSCanto citómetro de fluxo | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter do contador de partículas Z1 | Beckman-Coulter | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicador equipamento de processamento de líquido com MicroTip | Misonix | Modelo No. S-4000 |
Referências
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Reimpressões e permissões
