Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem

Summary

Neste artigo, nós descrevemos um método utilizando multi-espectral citometria de fluxo de imagem para quantificar a internalização de nanopartículas polianidrido ou bactérias por células RAW 264.7.

Abstract

Sistemas nanoparticulados surgiram como instrumentos valiosos na entrega de vacina através da sua capacidade para entregar eficientemente carga, incluindo proteínas, para as células apresentadoras de antigénio ^1-5. Internalização de nanopartículas (NP) por células apresentadoras de antigénio é um passo crítico na geração de uma resposta imune eficaz para o antigénio encapsulado. Para determinar como as mudanças em função de nanopartículas impacto formulação, buscou-se desenvolver um alto throughput, protocolo quantitativo experimental que era compatível com a detecção de nanopartículas internalizadas, bem como bactérias. Até à data, duas técnicas independentes, microscopia e citometria de fluxo, têm sido os métodos utilizados para estudar a fagocitose de nanopartículas. A natureza de alto rendimento da citometria de fluxo gera robustos dados estatísticos. No entanto, devido à baixa resolução, ele não consegue quantificar com precisão internalizado contra células nanopartículas encadernados. Microscopia gera imagens com alta resolução espacial; however, é demorado e envolve amostras de pequenas dimensões ^6-8. Multi-espectrais de citometria de fluxo de imagem (CFMI) é uma nova tecnologia, que incorpora os aspectos de microscopia e citometria de fluxo que executa várias cores de imagem de campo brilhante e fluorescência espectral simultaneamente através de um núcleo laminar. Este recurso fornece uma análise acurada da intensidade de sinal fluorescentes e as relações espaciais entre as diferentes estruturas e funções celulares em alta velocidade.

Aqui, nós descrevemos um método utilizando CFMI para caracterizar as populações de células que têm internalizado nanopartículas polianidrido ou Salmonella enterica sorovar Typhimurium. Descrevemos também a preparação de suspensões de nanopartículas, de rotulagem celular, aquisição de um sistema ^X ImageStream e análise dos dados usando o aplicativo IDÉIAS. Nós também demonstrar a aplicação de uma técnica que pode ser utilizado para diferenciar o p internalizaçãoathways para as nanopartículas e bactérias por utilizando citocalasina-D como um inibidor da actina mediada por fagocitose.

Protocol

1. Cultura de Células RAW 264,7

1. Colheita células RAW 264.7 de seus frascos quando atingem confluência raspando-as delicadamente com uma espátula de celulares. Contagem e da placa-los em um prato de cultura de 24 poços de células a uma densidade de 5 x 10 ⁵ células / poço em 0,5 mL de Dulbecco Modificado completa Eagle Médium (cDMEM; 10% inactivado pelo calor de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de Glutamax, e 10 mM de HEPES) e incubar durante a noite a 37 ° C em um 5% de CO ₂ incubadora.

2. Patogênica Salmonella enterica sorovar Typhimurium 14028 Transformação e Cultura

1. Introduzir pla....

Discussion

Estudos têm demonstrado que as nanopartículas biodegradáveis ​​à base de poli (ácido láctico-co-glicólico (PLGA), ou polianidridos podem ser utilizados para entregar antigénios encapsulados ou drogas às células alvo. Uptake destas nanopartículas pelas células fagocíticas é importante para a sua eficácia, tornando assim quantitativa . análise de internalização crítico na concepção de novos sistemas de entrega de nanopartículas Ao utilizar este método, a absorção diferencial de nanopartículas por vários tipos de células p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Linha de células RAW 264,7	American Type Culture Collection (ATCC)	TIB-71
Dulbecco modificado por Eagle (DMEM)	Cellgro	10-013-CV
Soro fetal de bovino	Atlanta Biologicals	S 11150	Nível de equipamento Premium
Glutamax	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
24-bem placa	TPP	92024
Frascos de cultura de células	TPP	90151
Raspador celular	TPP	99002	24 cm
Salmonella enterica sorovar Typhimurium	ATCC	14028
BTX ECM630 Manipulator célula eletroquímica	BTX Harvard Apparatus
MOPS	Fisher Scientific	BP308
Salina tamponada com fosfato (PBS)	Cellgro	21-040-CV
Processador líquido ultra-sônica	Misonix	S-4000
Citocalasina-D	Sigma-Aldrich,	C8273
Formaldeído	Polysciences	04018
O tampão de lavagem	2% de FBS inactivado calor, azida de sódio a 0,1% em PBS.
Perm / tampão de lavagem	BD Biosciences	554714
Clear-visualizar microtubos tampa de encaixe	Sigma	T4816
Alexa Fluor faloidina 660	Invitrogen	A22285
ImageStream X	Amnis Corporação	100200	Opções: 658nm laser, amostrador automático
A azida de sódio	Fisher Scientific	S 227I-500