Um método passo-a-passo para a reconstituição de um transportador ABC em partículas lipídicas Nanodisc

Resumo

Nanodiscs são pequenas partículas discóides que incorporam proteínas de membrana em um pequeno pedaço de bicamada de fosfolipídios. Nós fornecemos um protocolo visual que mostra a incorporação passo-a-passo do transportador MalFGK2 em um disco.

Resumo

O nanodisc é uma partícula discoidal (~ 10-12 nm grande) que as proteínas de membrana armadilha em um pequeno pedaço de bicamada de fosfolipídios. O nanodisc é uma opção particularmente atraente para o estudo de proteínas de membrana, especialmente no contexto de interacção ligando-receptor. O método pioneiro Sligar e colegas baseia-se nas propriedades anfipáticas de uma engenharia altamente helicoidal uma proteína derivada do andaime apolipoproteína A1. As faces hidrofóbicas da proteína andaime interagir com os acilo gordos de cadeias laterais na bicamada lipídica que as regiões polares enfrentam o meio ambiente aquoso. As análises de proteínas de membrana em nanodiscs têm vantagens significativas sobre os lipossomas porque as partículas são pequenas, homogénea e solúvel em água. Além disso, os métodos bioquímicos e biofísicos normalmente reservadas para proteínas solúveis pode ser aplicada, e a partir de ambos os lados da membrana. Neste protocolo visual, apresenta-se uma reconstituição passo-a-passo de uma caracte bemterizada transportador ABC bacteriana, o macho-MalFGK complexo _2. A formação do disco é um processo de auto-montagem, que depende de interacções hidrofóbicas que têm lugar durante a remoção progressiva do detergente. Descrevem-se os passos essenciais e destaca-se a importância de escolher a proporção entre proteína e lípido-correcta, a fim de limitar a formação de agregados maiores e polidispersos lipossoma partículas semelhantes. Qualidade simples controles, tais como cromatografia de filtração em gel, electroforese em gel nativa e espectroscopia de dispersão de luz dinâmica garantir que os discos foram correctamente reconstituído.

Protocolo

Processo geral de reconstituição

O processo de reconstituição é iniciado por mistura da proteína de membrana de andaime (MSP) purificado com o MalFGK complexo _2, na presença de detergente solubilizados fosfolípidos. O passo é seguido pela remoção lenta do detergente por um material adsorvente chamado poliestireno Bio-Beads ou Amberlite (Figura 1). O processo de auto-montagem ocorre provavelmente devido às interacções entre os fosfolípidos apolares hidrofóbicas, o MalFGK _dois complexos e a superfície da proteína MSP anfipática. O produto final é uma partícula discóide feito de duas moléculas de invólucro....

Discussão

Descreve-se um procedimento simples para a reconstituição do transportador de maltose em nanodiscs. O transportador é ATPase ativa e da interação com o macho parceiro solúvel ligação pode ser recriado (Figura 3). A reconstituição bem sucedida do transportador em nanodiscs abrir o caminho para análise biofísica e bioquímica suplementar. De interesse particular será a análise sistemática da ATPase Malk e maltose a actividade de transporte de detergente, lipossomas e nanodiscs. Transportadores ABC alterar .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Amicon Ultra-4 50K filtro centrífugo	Millipore	UFC805008	Siga o protocolo do fabricante para o uso adequado
Bio-Beads SM-2 Adsorvente	Bio-Rad	152-3920
E. coli lipídios totais	Lipídios Avanti Polar	100500C	Dissolvido em clorofórmio, como apropriado para tratar um solvente orgânico
Ni Sepharose HP resina	GE Healthcare	17-5268-01
Solução padrão de fósforo	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
			Reagentes tabela I. Específicos.
			Nome Composição Comentários DDM estoque 10% w / v DDM Ressuspender em milliQ água e armazenar a -20 ° C MalFGK estoque 2 1-2 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM de NaCl Glicerol a 10% v / v 0,03% w / v DDM Armazenar a -70 ° C, após purificação MSP estoque 10-15 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM de NaCl Glicerol a 10% v / v Armazenar a -70 ° C após purificação em alíquotas de 1 ml Estoque Phospholipid 5 nM E. coli de lipídios totais 0,5% w / v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl Armazenar a 4 ° C durante 1 semana TS tampão 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl Armazenar a 4 ° C TSG10 tampão 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM de NaCl Glicerol a 10% v / v Armazenar a 4 ° C TSG20 tampão 50 mM Tris-HCl, pH 8 100 mM de NaCl Glicerol a 20% v / v Armazenar a 4 ° C Tampão TSGD 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM de NaCl Glicerol a 10% v / v 0,03% w / v DDM Armazenar a 4 ° C e adiciona-DDM imediatamente antes da utilização Tabela II. Solução receitas.