Isolamento e cultivo de células neurais embrionárias de ratos: um protocolo rápido

Resumo

Nós descrevemos uma metodologia rápida para isolar e cultivar os neurônios do hipocampo e cortical a partir de embriões de roedores. Este protocolo permite a realização de experimentos em que quase puras culturas neuronais são necessários.

Resumo

Estamos descrevendo um método rápido para dissociar cultura e os neurônios do hipocampo ou cortical a partir de embriões de ratos E15-17. O procedimento pode ser aplicado com sucesso para o isolamento de rato e humanos neurónios primários e progenitores neurais. Neurónios dissociadas são mantidas em meio isento de soro até várias semanas. Estas culturas podem ser utilizados para nucleofection, imunocitoquímica, a preparação de ácidos nucleicos, bem como electrofisiologia. Mais velhos culturas neuronais também podem ser transfectadas com uma taxa de uma boa eficiência de transdução por lentivirus e, de forma menos eficiente, com fosfato de cálcio ou de lípidos métodos baseados em tais como lipofectamina.

Protocolo

1. Poli-D-lisina (PDL): Preparação

1. Adicionar 5 ml de _ddH2O estéril a 5 mg de PDL para se obter uma solução stock de 1 mg / ml.
2. Misture solução estoque pipetando várias vezes.
3. Use imediatamente ou guarde Poly-D-lisina solução a 2-8 ° C.

2. Poli-D-lisina (PDL): Revestimento de plástico pratos de cultura de células

1. Dilui-se a solução de reserva com PDL estéril _ddH2O para a concentração final de 10 ug / ml.
2. Pipetar solução suficiente para um prato 60 milímetros para cobrir a área de cultura de superfície (3 ml para um prato de 60 mm).
3. Balançar suavemente....

Discussão

O método de dissecção e cultura de neurónios do hipocampo de ratos e cortical aqui descrito permite a realização de experiências usando quase puros culturas neuronais cultivadas num meio quimicamente definido (Figura 3). Embora os protocolos para os neurónios de cultura quase puros em meios isentos de soro foram anteriormente descritos ^2,3,4, há alterações importantes feitas em nosso método. Diferente de protocolos tradicionais (isto é, Banker et al.) ^5, temos substituído com trips.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente	Concentração
Neurobasal	98%
B27	2%
Glutamax	0,5 mM

Quadro I. Neurobasal/B27 meio completo.

Reagente	Concentração
Glicose	16 mM
Sacarose	22 mM
HEPES	10 mM
NaCl	160 mM
KCl	5 mM
Na 2 HPO 4	1 mM
KH 2 PO 2	0,22 mM
Gentamicina	50 ug / ml
Fungizone	250 ng / ml
pH	7,4
Osmolaridade	320-330 mOsm

Tabela II. Meio de dissecção.

Reagente	Volume (uL)
Neurobasal/B27 meio completo	240
Trypan azul 0,4%	250
Total	490

Tabela III. 50x Contando solução.

Reagente	Companhia	Cat. número
E Hibernate	Brainbits	767171
Neurobasal	Gibco, Invitrogen	21103-049
B27	Gibco, Invitrogen	17504-044
Fungizone	Gibco, Invitrogen	15290-018
De sulfato de gentamicina	Sigma Aldrich	G1264
Glutamax mM 200	Gibco, Invitrogen	35050
TrypLE expresso vermelho w / o fenol	Gibco, Invitrogen	12604
Citosina-β-D-arabinofuranoside cloridrato	Sigma Aldrich	C6645
Poli-D-Lisina	Sigma Aldrich	P6407
A laminina 1 mg / ml	Millipore	CC095
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Trypan azul 0,4%	Gibco, Invitrogen	15250

Tabela IV. Reagentes específicos.

Equipamento	Companhia	Cat. número
Microscópio estéreo	Olimpo	SZ61
Pinças grandes	FST	11022-14
Pinça de ponta fina	Moria	MC40B
Micro pinça de ponta fina	Moria	MC31
Afiadas tesouras	Roboz	RS-6820
Micro tesoura de dissecção	FST	91460-11
Dissecando Micro tesoura curva	FST	14067-11
Vidro 2-câmara lâminas	Lab-Tek	154461
60 pratos mm	BD Falcon	353002
Placas de 100 mm	Corning	430167
15 ml tubos	BD Falcon	352099
1,5 ml frasco crio-tubo	Nunc	375353

Equipamentos Quadro V. específico.