Artigo de método
Circuitos neurais são topograficamente organizados em compartimentos funcionais específicas com perfis moleculares. Aqui, apresentamos os passos práticos e técnicos para revelar topografia cérebro global usando uma abordagem de coloração imuno-histoquímica wholemount versátil. Nós demonstrar a utilidade do método utilizando o citoarquitetura bem compreendida e os circuitos de cerebelo.
A arquitetura repetida e bem-entendido celular do cerebelo torná-lo um sistema modelo ideal para explorar a topografia do cérebro. Subjacente a sua citoarquitetura relativamente uniforme é um complexo conjunto de domínios parassagitais de expressão gênica e protéica. A compartimentação molecular do cerebelo é espelhada pela organização anatômica e funcional das fibras aferentes. Para apreciar plenamente a complexidade da organização do cerebelo que anteriormente uma abordagem refinada coloração wholemount para análise de defeitos de alto rendimento de padronização no cerebelo mouse. Este protocolo descreve em detalhes os reagentes, instrumentos e medidas práticas que são úteis para o sucesso revelar padrões de expressão de proteínas no cerebelo do rato adulto usando imunomarcação wholemount. Os passos em destaque aqui demonstrar a utilidade do presente método utilizando a expressão de zebrinII / aldolaseC como um exemplo de como a topografia fina do cérebro pode ser revelado na suaconformação tridimensional nativa. Também descritos são adaptações para o protocolo que permite a visualização de expressão da proteína em projeções aferentes e cerebelo grande para estudos comparativos de topografia molecular. Para ilustrar estas aplicações, os dados de coloração aferente do cerebelo de rato estão incluídos.
1. Perfusão Animal e Dissection Cerebelo
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Nós descrevemos os detalhes técnicos necessários para a coloração wholemount sucesso utilizando uma abordagem versátil imuno-histoquímica para expressão da proteína reveladora no cérebro em desenvolvimento e adultos. Usando esta abordagem, complexos moleculares padrões de expressão podem ser analisadas e topografia cérebro apreciado sem a necessidade de trabalhoso e demorado procedimentos de secção consumindo de tecidos.
Este protocolo foi usado para revelar a expressão padronizada de várias.......
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Não temos nada a divulgar.
RVS é suportado pelo investigador nova start-up fundos de Albert Einstein College of Medicine da Universidade de Yeshiva.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Materiais | Função no protocolo | ||
| Bomba de perfusão (Fisher Scientific/13-876-2) | Permite a perfusão consistente e lento. | ||
| Sharp-ponta Tesoura (FST/14081-08) | Uso geral na perfusão e dissecção. | ||
| Blunt-ponta Fórceps (FST/91100-12) | Para estabilizar o coração para inserção da agulha de perfusão. | ||
| Fórceps (FST por Dumont AA/11210-10) | Para utilização durante a dissecção do cérebro do crânio e para separar o cerebelo do resto do cérebro. Estes são essenciais porque eles têm uma ponta ligeiramente arredondada que ajuda a minimizar os danos ao cerebelo durante a dissecção. | ||
| Nutator (Fisher Scientific) | Utiliza-se para manter o tecido em movimento durante períodos de incubação. | ||
| 1,5 mL tubo (Sarstedt / Parafuso Micro Tube) | Todos os passos do seuhistoquímica protocolo ter lugar nestes microtubos. A parte inferior arredondada assegura que o cerebelo permanece em movimento. | ||
| Colher perfurada (FST/10370-17) | Usado para manter wholemounts nos microtubos enquanto suavemente decantação a solução passou. | ||
| Leica MZ16 FA microscópio | Usado para examinar coloração wholemount. | ||
| Leica DFC3000 FX câmera | Usado para capturar imagens wholemount. |
Tabela 1.
| Exemplo de calendário para um experimento típico wholemount | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Dia 1 | Correção Dent, temperatura ambiente, 8 horas | Lixívia Dent, 4 ° C, durante a noite | ||||||
| Dia 2 | 100% de MeOH, temperatura ambiente, 2x, 30 min cada | 100% MeOH, congelamento / descongelamento, 4x, 30 min/15 min | n = "2"> MeOH a 100%, -80 ° C, durante a noite | |||||
| Dia 3 | 50% MeOH/50% PBS, temperatura ambiente, 60-90 min | 15% de MeOH / PBS a 85%, à temperatura ambiente, 60-90 min | 100% de PBS, à temperatura ambiente, 60-90 min | 10μg/mL proteinase K em PBS, à temperatura ambiente, 2-3 min | 100% de PBS, à temperatura ambiente, 3x, 10 min cada | PMT, 4 ° C, durante a noite | ||
| Dia 4-5 | PMT + 1 ° de anticorpos + 5% de DMSO, 4 ° C, 48 horas | |||||||
| Dia 6 | PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 horas em cada | PMT + 2 ° anticorpo + 5% de DMSO, 4 ° C, 24 horas (ou iniciar a passos de amplificação com ABC complexo) | ||||||
| Dia 7 | PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 horas em cada | PBT, temperatura ambiente, 2 horas | Incubar em DAB fresco em PBS até que a coloração ideal é visualizado | |||||
| Receitas (* = preparar uma nova a cada vez) | |
|---|---|
| PBS (solução salina tamponada com fosfato) | 0,1 M de tampão fosfato salino em água desionizada. pH 7,2 (Sigma; comprimidos P4417) |
| PFA (paraformaldeído) | Feito e congelado armazenado como uma solução a 20% e, em seguida diluído para 4% em PBS para a solução de trabalho (Fisher Scientific; T353) |
| * Dent 3 de Fixação | 4 partes de metanol 1 parte dimetilsulfóxido (DMSO; Fisher Scientific, D159-4) |
| Bleach Dent 3 * | 4 partes de metanol 1 parte dimetilsulfóxido (DMSO; Fisher Scientific, D159-4) 1 parte de peróxido de hidrogênio a 30% |
| Digestão enzimática | 10 ug / ml de proteinase K (Roche Diagnostics; 03115828001) em PBS. |
| PBST | PBS contendo: 0,1% de Tween-20 (Fisher Scientific, BP337; Triton também pode ser utilizado em lugar de Tween-20 em todos os casos). |
| PMT 25 * | PBS contendo: 2% desnatado em pó de leite desnatado (Carnation preferido) 0,1% de Tween-20 (Fisher Scientific; BP337) |
| PBT 25 * | PBS contendo: Bovino a 0,2% (Sigma; B9001S) de albumina de soro 0,1% de Tween-20 (Fisher Scientific; BP337) |
| DAB * | Dissolve-se um comprimido de 10 mg de 3,3-diaminobenzidina (Sigma-Aldrich; D5905) em 40 ml de PBS. Adicionar 10 ul de peróxido de hidrogénio a 30% para iniciar a reacção). |
| ABC solução complexa | Vectastain kit (Vector Laboratories, Inc; PK-4000) |
Tabela 3.
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