Mutagênese Bissulfito Único de ovócitos

Resumo

Mutagênese bissulfito é o padrão ouro para a análise de metilação do DNA. Nosso protocolo modificado permite a análise de metilação do DNA ao nível de uma única célula e foi projetado especificamente para oócitos individuais. Também pode ser utilizado para a clivagem do estágio-embriões.

Resumo

Epigenética engloba todas hereditárias e modificações reversíveis de cromatina que alter acessibilidade gene e, portanto, são os principais mecanismos de regulação da transcrição do gene ^1. Metilação do DNA é uma modificação epigenética, que atua predominantemente como uma marca repressiva. Através da adição covalente de um grupo metilo em citosinas na dinucleótidos CpG, pode recrutar adicionais proteínas repressores e modificações histona para iniciar processos envolvidos na condensação da cromatina e silenciamento de genes ^2. Metilação do DNA é essencial para o desenvolvimento normal, pois desempenha um papel fundamental na programação do desenvolvimento, diferenciação celular, a repressão de elementos retrovirais, inativação do cromossomo X e imprinting genômico.

Um dos métodos mais poderosos para a análise de metilação de DNA é a mutagénese bissulfito. Bissulfito de sódio é um agente mutagénico DNA que deaminates citosinas em uracilos. Após amplificação por PCR e Seque ncing, estes eventos de conversão são detectados como timinas. Citosinas metiladas são protegidos de desaminação e, assim, permanecer como citosinas, permitindo a identificação de metilação de ADN a nível individual de nucleótidos ^3. Desenvolvimento da mutagênese bissulfito avançou daqueles originalmente informados ^4-6 para aqueles que são mais sensíveis e reprodutíveis ^7. Um avanço chave foi a incorporação de pequenas quantidades de DNA em um grânulo de agarose, protegendo assim o DNA a partir do tratamento com bissulfito dura ^8. Esta análise de metilação habilitado a ser realizada em piscinas de oócitos e embriões em estágio de blastocisto ^9. O protocolo de mutagênese mais sofisticado bissulfito de data é para cada estágio de blastocisto-embriões ^10. No entanto, uma vez que os blastocistos têm, em média 64 células (contendo 120-720 pg de DNA genómico), este método não é eficaz para os estudos de metilação em oócitos individuais ou de clivagem-stage embriões. tenda "> Tomar pistas de agarose incorporação de quantidades de DNA minutos, incluindo oócitos ^11, aqui apresentamos um método pelo qual os oócitos são diretamente incorporado em um agarose e solução de lise talão de recuperação imediatamente a seguir e remoção da zona pelúcida do ovócito. Isso nos permite ignorar os dois principais desafios da mutagénese único oócito bissulfito:. protectores uma pequena quantidade de DNA a partir de degradação, e subsequente perda durante os passos do protocolo numerosas importante, como os dados são obtidos a partir de oócitos individuais, a questão da PCR viés dentro piscinas é eliminado Além disso. , a contaminação de células do cumulus inadvertida é detectável por este método uma vez que qualquer amostra com mais do que um padrão de metilação pode ser excluídos da análise ^12. Este protocolo fornece um método melhorado para análises de sucesso e reprodutível de metilação do DNA ao nível de uma única célula e é idealmente adequado para oócitos individuais, bem como estágios de clivagem dos embriões.

Protocolo

DIA 1

Prepare as seguintes soluções frescas no dia da coleta de oócitos com água destilada estéril como GIBCO água. Para reduzir a chance de contaminação de DNA, mudar frequentemente e usar luvas de pontas com filtro. Manter tubos angular longe quando aberto, e recapitular todos os tubos quando não em uso. Sugerimos que as soluções são feitas como se n +1.

3% de agarose LMP

30 mg baixo ponto de fusão (LMP) Agarose
até 1 ml _de H2O GIBCO
dissolver @ 70 ° C

Solução de lise

8 ul de tampão de lise
1 uL de p....

Discussão

Este ensaio único óvulo contém muitas etapas com um número que são críticas e requerem cuidados especiais. A primeira é a lavagem do oócito. É particularmente importante para lavar cada oócito várias vezes em meio fresco cai após o tratamento hialuronidase para remover as células do cumulus tantas quanto possível. Além disso, quando a transferência de ovócitos a solução ácida de Tyrode para zona pelúcida remoção certifique-se envolvente meio é claro de células do cumulus. O oócito é muito pegajosa após a remoção zona, e.......

Materiais

Tabela de reagentes específicos e equipamentos.

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Recolha de ovócitos
Hialuronidase	Sigma	H4272
Ácida de Tyrode	Sigma	T1788
Proteinase K	Sigma	P5568
IGEPAL 10%	Bioshop	NON999.500
Solução de lise
Tris pH 7,5	Bioshop	TRS001.5
LiCl	Sigma	L9650	& Nbsp;
EDTA pH 8,0	Sigma	E5134
LIDS	Bioshop	LDS701.10
TDT	Invitrogen	P2325
SDS Tampão de Lise
TE pH 7,5	Bioshop (Tris) Sigma (EDTA)	TRS001.5 E5134
10% de SDS	Bioshop	SDS001.500
Conversão Bissulfito
Hidróxido de Sódio	Sigma	S8045
Hidrogenossulfito de sódio (bissulfito de sódio)	Sigma	243973	;
Hidroquinona	Sigma	H9003
Baixo ponto de fusão (LMP) Agarose	Sigma	A9414
Óleo mineral	Sigma	M8410
Meio M2	Sigma	M7167
GIBCO água destilada	Invitrogen	15230-196
Autoclavado duas vezes água destilada (dd)
PCR
Illustra Iniciar Hot Mix RTG	GE Healthcare	28-9006-54
240 ng / ml de levedura tRNA	Invitrogen	15401-011
Tampão de reacção 5x Verde GoTaq	PróMega	M7911
Interno e externo primers aninhados	Sigma
Ligadura
Promega pGEM-T Vector Fácil	Fisher Scientific	A1360
TA Cloning
Competentes células de E.coli	Zymo Research Corp	T3009
Equipamento
Microscópio de dissecção
70 ° C e 90 ° C Calor Blocos
37 ° C e 50 ° C Os tanques de imersão (42 ° C para as transformações)
Cadeira de balanço
Máquina de PCR